百茹峰，賈振軍，姜立喆，呂小嬌，袁麗，石美森

插入/缺失多態(tài)性(insertion/deletion polymorphisms，InDel)是指基因組中插入或缺失不同大小的DNA片段所形成的多態(tài)性遺傳標(biāo)記[1]。2002年，Weber等[2]最早報(bào)道了2000個(gè)二等位基因InDel標(biāo)記的遺傳特征、定位以及在四大種群中的等位基因頻率。在此基礎(chǔ)上，Mills等[3]2006年在Genome Research雜志上發(fā)表了一個(gè)包含了人類(lèi)基因組中415 000余個(gè)InDel標(biāo)記的圖譜，這一工作大大地促進(jìn)了InDel在各領(lǐng)域的應(yīng)用研究[4-7]。從法醫(yī)學(xué)應(yīng)用角度來(lái)看，InDel遺傳標(biāo)記具備更低的突變率(代間突變率STR 10-3；SNP 2.3×10-8；InDel 2.3×10-9[8-9])、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度可以極大縮短應(yīng)用于DNA高度降解檢材，由于其兼具了STR和SNP兩種遺傳標(biāo)記的雙重優(yōu)點(diǎn)且能夠與普遍使用的STR分型技術(shù)平臺(tái)相兼容，受到了國(guó)內(nèi)外法醫(yī)學(xué)者的關(guān)注[10-13]。目前成熟的InDel商品化試劑盒為Investigator? DIP，本研究擬對(duì)該體系中的30個(gè)InDel位點(diǎn)在新疆維吾爾族人群中的等位基因頻率和遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析，以建立新疆維吾爾族群體30個(gè)InDel位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)資料，為法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定、疾病相關(guān)基因分析及人類(lèi)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本及儀器 本研究在當(dāng)?shù)匦l(wèi)生行政部門(mén)的支持配合下采取知情同意的原則, 隨機(jī)選取采集223名新疆維吾爾族無(wú)關(guān)男性個(gè)體外周血樣，置于FTA采血卡上，－20℃保存。Investigator? DIP試劑盒(Qiagen公司，德國(guó))；9700型擴(kuò)增儀(PE公司，美國(guó))；3130 XL型遺傳分析儀(Life Technologies公司，美國(guó))；微量移液器、高速離心機(jī)(Eppendorf公司，德國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 采用5% Chelex-100快速提取法提取樣本DNA。采用5μl復(fù)合擴(kuò)增體系，含反應(yīng)混合物A1.0μl，引物1.0μl，多重Taq2 DNA聚合酶0.2μl，模板DNA 0.5～1.0ng，補(bǔ)滅菌去離子水至5μl。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，61℃復(fù)性120s，72℃延伸75s，30個(gè)循環(huán)；最后68℃延伸60min，10℃保溫。PCR 產(chǎn)物變性后在3130 XL型遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，用GeneMapper ID v3.2軟件對(duì)30個(gè)InDel位點(diǎn)和性別基因座Amelogenin進(jìn)行分型，每批樣本檢測(cè)均采用XX28和超純水分別作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用 Power Stats v12.xls軟件(http://www.promega.com/geneticidtools/powerstats)統(tǒng)計(jì)分析30個(gè)InDel位點(diǎn)的等位基因頻率、個(gè)體識(shí)別率(probability of discrimination power，DP)、多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)和非父排除率(probability of exclusion，PE)等法醫(yī)學(xué)相關(guān)參數(shù)；采用Cervus 3.0(http://www.field genetics.com/pages/home.jsp)軟件計(jì)算三聯(lián)體非父排除率(PEtrio)和二聯(lián)體非父排除率(PEduo)。采用Arlequin 3.5軟件(http://cmpg.unibe.ch/software /arlequin3.5)計(jì)算30個(gè)InDel位點(diǎn)的觀察值雜合度(heterozygosity of observation，Ho)和期望值雜合度(heterozygosity ofexpect，He)，并進(jìn)行各位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡、位點(diǎn)間連鎖不平衡檢驗(yàn)。采用Wrigh公式[14]計(jì)算各群體間遺傳分化系數(shù)Fst。采用XLSTAT(version 2009.4.07；Addinsoft SARL, http://www.xlstat.com/en/company/)進(jìn)行多維尺度(multi-dimensional scaling，MDS)分析。

2 結(jié) 果

2.1 30個(gè)InDel位點(diǎn)的等位基因分型結(jié)果 在223份新疆維吾爾族無(wú)關(guān)男性個(gè)體血樣中，Investigator?DIP試劑盒中的30個(gè)InDel位點(diǎn)都得到了有效擴(kuò)增，無(wú)Stutter峰，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度均在76～158bp之間，純合子只顯現(xiàn)1個(gè)等位基因峰，雜合子則有2個(gè)等位基因峰且峰高比例＞70%(圖1)。

圖1 Investigator? DIP中的30個(gè)InDel位點(diǎn)在1例新疆維吾爾族男性個(gè)體的基因分型結(jié)果Fig.1 The genotype of 30 InDel loci in one Xinjiang Uygur ethnic male amplified using Investigator? DIPplex Kit

表1 新疆維吾爾族群體30 個(gè)InDel位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)參數(shù)Tab.1 The population genetic parameters of 30 InDel loci in Chinese Uygur ethnic group living in Xinjiang

2.2 新疆維吾爾族族群體30個(gè)Indel位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)參數(shù) 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表1，各位點(diǎn)觀察值雜合度(Ho)為0.3857～0.5381，平均觀察值雜合度為0.4686；期望值雜合度(He)為0.3770～0.5011，平均期望值雜合度為0.4738。采用Bonferroni法校正，將P值設(shè)為0.0017(0.05/30)，30個(gè)InDel位點(diǎn)的基因型頻率分布在新疆維吾爾族群體中均達(dá)到Hardy-Weinberg平衡(P＞0.0017)。30個(gè)InDel位點(diǎn)的缺失等位基因頻率在0.2510～0.6860之間，除HLD64、HLD81位點(diǎn)外，其余28個(gè)位點(diǎn)的缺失等位基因頻率在0.3000～0.7000之間，顯示30個(gè)InDel位點(diǎn)在新疆維吾爾族群體的等位基因頻率分布相對(duì)較均衡；個(gè)體識(shí)別率(DP)為0.5430～0.6470，平均為0.6095；多態(tài)信息含量(PIC)為0.31～0.37，平均為0.36；三聯(lián)體非父排除率(PEtrio)為0.1050～0.2190；二聯(lián)體非父排除率(PEduo)為0.0707～0.1250。

2.3 新疆維吾爾族群體30個(gè)InDel位點(diǎn)的連鎖不平衡檢驗(yàn) 30個(gè)InDel位點(diǎn)兩兩之間共進(jìn)行435次連鎖不平衡檢驗(yàn)，其中有23次比較結(jié)果的P值低于檢驗(yàn)水準(zhǔn)0.05，界于0.004 28～0.048 67之間，且該23對(duì)兩兩比較的位點(diǎn)均位于不同的染色體上，經(jīng)過(guò)Bonferroni法校正，將P值設(shè)為0.000 115(0.05/435)后各位點(diǎn)間均不存在連鎖不平衡現(xiàn)象(P＞0.000 115)。

2.4 新疆維吾爾族群體與其他群體的遺傳分化系數(shù)Fst及多維尺度分析(MDS) 從已報(bào)道的文獻(xiàn)中找到與本研究相同的30個(gè)InDel位點(diǎn)的群體：北京漢族[14]、廣東漢族[15]、漢族[16]、維吾爾族[16]、哈薩克族[16]、藏族[16]、朝鮮[17]、葡萄牙[18]、丹麥[19]、捷克[20]、德國(guó)[20]、西班牙[21]、巴斯克[21]、高加索裔美國(guó)人[22]、拉美裔美國(guó)人[22]、非裔美國(guó)人[22]及亞裔美國(guó)人[22]，計(jì)算的遺傳分化系數(shù)Fst值見(jiàn)表2，遺傳距離見(jiàn)表3，多維尺度分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

表2 30個(gè)InDel 遺傳標(biāo)記在18個(gè)群體中的Fst值Tab.2 Fst based on the comparison of allele frequencies F(del) in 18 population studies using 30 Indels in the DIPplex? kit

3 討 論

維吾爾族是古代北亞民族的回鶻和中亞中世紀(jì)各穆斯林的后裔，世界維吾爾族人口1250萬(wàn)，其中大部分都在中國(guó)新疆維吾爾自治區(qū)居住，2011年中國(guó)第六次人口普查顯示，中國(guó)境內(nèi)的維吾爾族人口為10 069 347人，占中國(guó)人口的0.7555%，是中國(guó)第4大少數(shù)民族。本研究選擇Investigator? DIPplex試劑盒中的30個(gè)InDel位點(diǎn)對(duì)新疆維吾爾族群體進(jìn)行遺傳多態(tài)性調(diào)查，同時(shí)探討其與其他群體之間的遺傳學(xué)關(guān)系，有助于分析InDel遺傳標(biāo)記在不同民族或同一民族不同群體間的遺傳、進(jìn)化的相互關(guān)系，為科學(xué)應(yīng)用InDel遺傳標(biāo)記提供理論基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)Bonferroni法校正，30個(gè)InDel位點(diǎn)的基因型頻率分布在新疆維吾爾族群體中達(dá)到Hardy-Weinberg遺傳平衡，因此本研究樣本是可靠的。連鎖不平衡檢驗(yàn)結(jié)果表明，30個(gè)InDel位點(diǎn)在西藏藏族群體中不存在連鎖不平衡現(xiàn)象(P＞0.000 115)，提示這些位點(diǎn)是相互獨(dú)立的遺傳標(biāo)記，可以應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)鑒定。對(duì)InDel遺傳標(biāo)記的多態(tài)性及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值一般可用PIC、Ho、He、PD和PE等指標(biāo)來(lái)衡量，本研究各位點(diǎn)等位基因頻率F(del)為0.2510～0.6860，觀察值雜合度(Ho)為0.3857～0.5381，平均觀察值雜合度為0.4686；期望值雜合度(He)為0.3770～0.5011，平均期望值雜合度為0.4738；多態(tài)信息含量(PIC)為0.31～0.37；個(gè)體識(shí)別率(DP)為0.5430～0.6470，累積個(gè)體識(shí)別率(TDP)為0.999 999 999 999 5；30個(gè)InDel位點(diǎn)的累積非父排除率(CPEtrio)為0.995 478，二聯(lián)體累積非父排除率(CPEduo)為0.972 007，綜合各文獻(xiàn)群體[15-23]的相應(yīng)數(shù)據(jù)亦均不能達(dá)到0.9999，因此Investigator?DIP試劑盒目前只能作為法醫(yī)常規(guī)STR分型試劑盒的有效補(bǔ)充。由表1觀察發(fā)現(xiàn)維吾爾族群體中F(del)、Ho、DP、PIC、PEduo、PEtrio的最小值均在HLD64位點(diǎn)出現(xiàn)，此外，HLD111、HLD118、HLD99及HLD39等位點(diǎn)在本研究及已報(bào)道的研究群體[15-17]中的雜合度及PIC也較低，提示這些位點(diǎn)可能在亞洲人群中的遺傳多態(tài)性較低。

表3 新疆維吾爾族群體與其他17個(gè)群體的遺傳距離Tab.3 Comparison of the genetic distance among 18 different races and ethnic groups

圖2 新疆維吾爾族與其他17個(gè)群體的30個(gè)InDel等位基因頻率MDS分析結(jié)果Fig.2 MDS plot based on the pairwise correlations of Indels allele frequencies across 18 populations

Fst又稱(chēng)為近交系數(shù)，是進(jìn)行群體間遺傳分化概括分析最常用的方法之一。Fst指示特定基因座位在群體間的分化程度。Wright等[14]認(rèn)為群體間Fst值在0～0.05表示群體間不存在分化；Fst值在0.05～0.15則為中度分化；Fst值在0.15～0.25則為高度分化，大于0.25則分化度極大。本研究中，HLD111和HLD118等位點(diǎn)Fst值均大于0.15，在18個(gè)群體中遺傳分化貢獻(xiàn)率相對(duì)較高。提示這兩個(gè)位點(diǎn)在不同民族尤其是不同人種中基因型分布有很大差異，反映群體差異性大，在群體遺傳學(xué)和種群識(shí)別方面有重要的應(yīng)用價(jià)值。

遺傳距離亦是表示群體間遺傳差異或遺傳分化的重要參數(shù)，是以兩個(gè)群體間同一座位上相同等位基因的頻率差異的函數(shù)來(lái)測(cè)定的。本研究中的新疆維吾爾族和國(guó)內(nèi)漢族、其他民族及歐美等群體的遺傳距離差異由小到大依次為:維吾爾族2(0.240)→哈薩克族(0.312)→藏族(0.575)→歐美白種人(0.507～0.686)→漢族及亞洲裔群體(0.577～0.734)→非裔美國(guó)人(1.089)，維吾爾族群體與漢族群體間的遺傳距離大于其與歐美白種人群。從MDS的散點(diǎn)圖結(jié)果亦可以看出，18個(gè)比較人群大致可以劃分成4個(gè)類(lèi)群，分別是：第一類(lèi)群，非裔美國(guó)人(尼格羅人種)；第二類(lèi)群，丹麥、捷克、高加索裔美國(guó)人、德國(guó)、拉美裔美國(guó)人、西班牙、巴斯克、葡萄牙構(gòu)成的白種人組群；第三類(lèi)群，兩個(gè)維吾爾族及哈薩克族；第四類(lèi)群，藏族、漢族、北京漢族、廣東漢族、亞裔美國(guó)人及朝鮮人構(gòu)成的蒙古人種族群。結(jié)合本研究結(jié)果，并參考有關(guān)歷史文獻(xiàn)、當(dāng)?shù)氐牡乩怼⒚袼缀臀幕祟?lèi)學(xué)研究的成果[24-25]，我們認(rèn)為，維吾爾族有較大比例的高加索人種的混雜程度，有別于屬于蒙古人種的漢族和藏族。另外，維吾爾族和哈薩克族有著共同的宗教信仰，而且在兩個(gè)民族的形成和發(fā)展中很可能有著相同或相近的淵源，因此遺傳距離相近。這些結(jié)果基本符合從歷史、考古、語(yǔ)言、地理和體質(zhì)人類(lèi)學(xué)等方面進(jìn)行的劃分，充分表明以InDel遺傳標(biāo)記的等位基因頻率為基礎(chǔ)計(jì)算的遺傳距離及MDS分析，能夠適用于群體遺傳學(xué)和民族、種族研究。

綜上，本研究首次獲得了新疆維吾爾族群體HLD77等30個(gè)InDel位點(diǎn)的等位基因頻率及基因型分布數(shù)據(jù)，為建立新疆地區(qū)維吾爾族群體InDel分布數(shù)據(jù)庫(kù)、群體遺傳關(guān)系的分析及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了良好的遺傳背景數(shù)據(jù)。

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