吳光聲，高峰，沈征，毛姍姍，沈玨，袁哲峰，李珊

全面性癲癇伴熱性驚厥附加癥(generalized epilepsy with febrile seizures plus, GEFS+)是一種常見(jiàn)的在兒童期發(fā)病的家族性遺傳性癲癇綜合征。自1997年Scheffer與Berkovic[1]首次報(bào)道以來(lái)，GEFS+越來(lái)越受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注并作為一種新的綜合征在2001年被國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟(International League Against Epilepsy)列入癲癇綜合征分類(lèi)[2]中。目前，研究主要集中在此病的致病基因上[3]，已證實(shí)的相關(guān)致病基因有5種離子通道蛋白亞單位，分別為編碼電壓門(mén)控鈉離子α1、α2、β1亞單位的SCN1A、SCN2A、SCN1B基因與編碼配體門(mén)控氯離子通道GABAA受體γ2、δ亞單位的GABRG2、GABRD基因。本研究將對(duì)收集到的10個(gè)GEFS+家系進(jìn)行臨床表型分析及SCN1A基因研究，探討SCN1A基因在我國(guó)GEFS+家系中的突變情況。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 搜集2011年3月－2013年8月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院神經(jīng)科門(mén)診及住院的10個(gè)GEFS+家系，對(duì)每個(gè)家系受累成員均建立臨床登記表，內(nèi)容包括姓名、性別、出生日期、民族、發(fā)病年齡、發(fā)作時(shí)表現(xiàn)、圍產(chǎn)期情況、既往史、家族史、用藥史及輔助檢查結(jié)果。另取50例正常兒童用于進(jìn)行測(cè)序?qū)φ铡?/p>

1.2 家系成員表型分析 根據(jù)ILAE 2010年癲癇發(fā)作與癲癇綜合征分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[4]，對(duì)所有先證者及家系其他受累成員的臨床表現(xiàn)、腦電圖及頭顱影像學(xué)資料進(jìn)行分析，繪制家系圖。

1.3 SCN1A基因突變篩查 采用DNA直接測(cè)序法。應(yīng)用SeqmanTM軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果與SCN1A正常序列進(jìn)行比對(duì)，當(dāng)突變點(diǎn)在尾部、雜峰較多、信號(hào)偏低時(shí)給予反向引物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。正常序列為GenBank中SCN1A全基因組序列(NC_000002)，編碼區(qū)序列(CDS-AB093548)，蛋白質(zhì)序列(P35498)。如發(fā)現(xiàn)SCN1A基因編碼區(qū)異常，則對(duì)50例正常對(duì)照及患兒家系成員相應(yīng)片段進(jìn)行測(cè)序、比對(duì)，以排除單核苷酸多態(tài)性(SNP)并確定突變來(lái)源。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 10個(gè)家系共有33例受累者，每個(gè)家系受累人數(shù)不等。受累者的臨床表型包括熱性驚厥(febrile seizures，F(xiàn)S)11例(33.3%)，熱性驚厥附加癥(febrile seizures plus，F(xiàn)S+)11例(33.3%)，F(xiàn)S或FS+伴部分性發(fā)作1例(3.0%)，無(wú)熱全面強(qiáng)直陣攣發(fā)作(afebrile generalized tonic-clonic seizures，AGTCS)3例(9.1%)，Dravet綜合征1例(3.0%)，兒童失神癲癇1例(3.0%)，發(fā)作分類(lèi)不能明確5例(15.2%)。

2.2 SCN1A基因突變篩查結(jié)果 10個(gè)GEFS+家系先證者中，3例先證者存在SCN1A基因突變。進(jìn)一步分析了他們所在家系成員的SCN1A基因，以明確其突變來(lái)源。

家系1先證者，男，4歲8個(gè)月，11個(gè)月大時(shí)首次出現(xiàn)發(fā)熱伴抽搐，11個(gè)月－3歲共發(fā)作熱性驚厥10余次，3歲1個(gè)月出現(xiàn)無(wú)熱抽搐，發(fā)作類(lèi)型為AGTCS，每次發(fā)作持續(xù)2～5min，常在運(yùn)動(dòng)或勞累后發(fā)作，近1年共發(fā)作5次。其家系中共有6位受累者，先證者外公(Ⅰ-1)FS、母親(Ⅱ-2)FS+、姨媽(Ⅱ-7)FS+、姐姐(Ⅲ-2)FS、表哥(Ⅲ-7)AGTCS(圖1A)。SCN1A基因突變篩查結(jié)果(圖1B)顯示，在先證者第23外顯子發(fā)現(xiàn)雜合突變c.4330G＞A，遺傳密碼子由GAA變成AAA，導(dǎo)致1444位谷氨酸被賴(lài)氨酸取代，該突變?yōu)殄e(cuò)義突變。該家系5個(gè)受累者的SCN1A基因存在與先證者完全相同的基因突變，而先證者未受累的兩個(gè)姨媽(Ⅱ-3，Ⅱ-5)和其表姐(Ⅲ-3)，表哥(Ⅲ-4)未在該位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)突變(圖1B)。

圖1 家系1的家系圖及SCN1A基因測(cè)序結(jié)果Fig. 1 Pedigree of family 1 sequencing results of SCN1A gene

家系2(圖2)：先證者，男，8歲7個(gè)月。1歲時(shí)首次出現(xiàn)發(fā)熱伴抽搐，1－7歲間有熱驚厥，每年發(fā)作2～3次，7歲2個(gè)月出現(xiàn)無(wú)熱抽搐，發(fā)作類(lèi)型為AGTCS，2011年11月起開(kāi)始口服丙戊酸鈉緩釋片0.25g/次，2次/d，此后未再發(fā)作驚厥。其家系中共有6個(gè)受累者，先證者奶奶(Ⅰ-2)表型為FS+、姨媽(Ⅱ-15)FS、堂哥(Ⅲ-3)FS+、堂弟(Ⅲ-4)FS、表姐(Ⅲ-7)FS+、表弟(Ⅲ-11)AGTCS、表弟(Ⅲ-17)FS+(圖2A)。SCN1A基因突變篩查結(jié)果(圖2B)顯示，在先證者第15外顯子發(fā)現(xiàn)雜合突變(c.2592G＞A)，遺傳密碼子由ACG變成ACA，為同義突變。先證者母親的SCN1A基因存在與先證者完全相同的基因突變，父親的SCN1A基因未發(fā)現(xiàn)突變。家系中其他成員血樣未能獲得。

圖2 家系2的家系圖及SCN1A基因測(cè)序結(jié)果Fig. 2 Pedigree of family 2 sequencing results of SCN1A gene

家系3先證者，男，3歲1個(gè)月時(shí)首次出現(xiàn)發(fā)熱伴抽搐，發(fā)作類(lèi)型FS，其家系中共有2個(gè)受累者，先證者母親(Ⅱ-3)，姨媽(Ⅱ-2)表型為FS+(圖3A)。SCN1A基因突變篩查結(jié)果(圖3B)顯示，在先證者第9外顯子(c.1212G＞A)和26外顯子(c.5385 G＞A)的突變?yōu)橥x突變。家系中其他成員血樣未能獲得。

圖3 家系3的家系圖及SCN1A基因測(cè)序結(jié)果Fig. 3 Pedigree of family 3 sequencing results of SCN1A gene

3 討 論

SCN1A基因?yàn)镚EFS+家系的重要致病基因，為常染色體顯性遺傳，研究報(bào)道具有外顯率不全等特點(diǎn)(外顯率為60%～70%)[5]。本研究中，家系1中全部受累者均存在SCN1A基因突變，未受累者中未發(fā)現(xiàn)SCN1A突變情況，外顯率達(dá)100%，但本研究中有一些家系成員的標(biāo)本未采集全，可能對(duì)結(jié)果有所影響。雖然同樣是受累者，但患者的臨床表型譜多樣，即使同一家系受累成員亦可有多種不同表型。常見(jiàn)的臨床表型有熱性驚厥(FS)[6-7]、熱性驚厥附加癥(FS+)，F(xiàn)S/FS+伴其他全身性發(fā)作(如失神、肌陣攣和失張力發(fā)作等)，其他少見(jiàn)如無(wú)熱強(qiáng)直陣攣發(fā)作、少年肌陣攣癲癇(JME)，MAE和Dravet綜合征。本研究的家系中未見(jiàn)Doose綜合征或Dravet綜合征等癲癇性腦病的表型。分析原因可能是因?yàn)檫@些表型少見(jiàn)，并且家系中也有多名受累者無(wú)法獲得詳細(xì)臨床資料，所以無(wú)法進(jìn)行臨床分型有關(guān)。

SCN1A基因是與癲癇發(fā)病相關(guān)最重要的基因之一，與其突變引起的常見(jiàn)癲癇綜合征有Dravet綜合征、GEFS+，其他少見(jiàn)的如Doose綜合征、West綜合征、Lennox-Gastaut綜合征等[8-9]。研究報(bào)道Dravet綜合征患兒中，80%存在SCN1A突變[10]，突變部位多位于鈉離子的關(guān)鍵區(qū)域(S4-S6)，且其中絕大多數(shù)(95%)突變?yōu)闊o(wú)家族遺傳傾向的新生突變，5%來(lái)自父母，但父母往往臨床表型輕微。在GEFS+中，SCN1A突變率、突變部位和突變來(lái)源與Dravet綜合征均存在很大差異，突變位點(diǎn)分布于整個(gè)基因，大多數(shù)在鈉離子通道的核心形成區(qū)域(S4－S6)以外的部位[11]。本研究的家系1以及國(guó)內(nèi)許小箐等[12]對(duì)39個(gè)家系進(jìn)行SCN1A的突變研究中2個(gè)錯(cuò)義突變的家系位于鈉通道α亞單位S4～S6重要功能區(qū)，該功能區(qū)為電壓感受和門(mén)控區(qū)，可影響細(xì)胞興奮性[13]。以上3個(gè)家系中未見(jiàn)嚴(yán)重表型，臨床表型譜也主要以FS和FS+為主，說(shuō)明在GEFS+家系中，SCN1A突變位置與其臨床表型嚴(yán)重程度并未存在必然聯(lián)系。

國(guó)外有報(bào)道顯示，在GEFS+家系常染色體顯性遺傳[14-15]之外，可能存在多基因協(xié)同作用。另有文獻(xiàn)報(bào)道，在GEFS+家系中部分成員存在兩種不同的基因突變[16]。本研究家系2中父母雙方均有熱性驚厥家族史，因先證者和母親都存在相同的15號(hào)外顯子雜合突變(c. 2592G＞A)，故其SCN1A基因突變來(lái)自母系，但是由于未能測(cè)定母系其他受累者是否具備相同的基因突變，所以尚不能肯定該突變?yōu)橹虏⊥蛔?，?duì)于是否存在雙系遺傳，需完善父系其他成員的SCN1A檢測(cè)，及對(duì)先證者和父系其他離子通道基因的篩查。家系3中存在SCN1A第9和第26兩個(gè)外顯子的同義突變，說(shuō)明GEFS+家系在遺傳方式上的復(fù)雜性和多樣性，因未能采集家系中父母及其他成員血樣，所以無(wú)法明確該突變是來(lái)自單純母系或父母雙方，至于是否為致病突變則有待完善家系中其他成員的基因篩查才能確定。既往認(rèn)為同義突變大都被視為無(wú)義突變，國(guó)外尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)GEFS+家系同義突變進(jìn)行報(bào)道，國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)將先證者的同義突變視為單核苷酸多態(tài)性，未對(duì)家系其他成員做進(jìn)一步的基因檢測(cè)和分析[17]。但越來(lái)越多的研究表明，同義突變會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能，如引起mRNA剪接異常[18]，影響mRNA穩(wěn)定性等，從而影響蛋白質(zhì)的表達(dá)和酶的活性[19]。另外，有關(guān)密碼子的偏倚影響蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)假說(shuō)，也于2007年得到證實(shí)[20]。本研究的局限在于，前期研究者對(duì)于同義突變意義的認(rèn)識(shí)不足，加上家屬配合度不高，未能對(duì)家系2和3的血樣采集進(jìn)行完善并進(jìn)一步分析，希望在后續(xù)的研究中能得以完善。

GEFS+是一種離子通道病，與其相關(guān)的致病基因有5種離子通道蛋白亞單位基因(SCN1A、SCN2A、SCN1B、GABRG2、GABRD)，分別為編碼電壓門(mén)控鈉離子α1、α2、β1亞單位和編碼配體門(mén)控氯離子通道的GABAA受體γ2、δ亞單位，但突變檢出率低，SCN1A基因突變率普遍在10%左右。本研究在10個(gè)GEFS+家系研究中發(fā)現(xiàn)1個(gè)新的錯(cuò)義突變c.4330G＞A和3個(gè)同義突變，其中一個(gè)家系存在2個(gè)外顯子同時(shí)突變情況，另外7個(gè)家系未發(fā)現(xiàn)SCN1A基因突變。GEFS+家系遺傳機(jī)制復(fù)雜，SCN1A基因是其中一種重要的致病基因，對(duì)于SCN1A突變家系需進(jìn)一步完善家系其他成員的基因篩查。另外，對(duì)本研究10個(gè)家系進(jìn)行其他離子通道相關(guān)基因或全基因組的檢測(cè)，將有助于進(jìn)一步明確其遺傳發(fā)病機(jī)制。

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