尹豐，張劍寧，趙明明，周春輝，王淑為，郭欣如，劉爽

腦膠質(zhì)瘤是成年人最常見(jiàn)的惡性腦腫瘤，盡管手術(shù)、放化療等傳統(tǒng)治療方法目前已有了很大改進(jìn)，但惡性膠質(zhì)瘤的預(yù)后仍不理想，特別是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，患者平均生存期僅為14個(gè)月[1]。最近的研究顯示腦腫瘤中存在一小部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群，即腦腫瘤干細(xì)胞(BTSCs)，目前認(rèn)為BTSCs是腦腫瘤發(fā)生發(fā)展的根源以及產(chǎn)生放化療抗性和腫瘤復(fù)發(fā)的原因[2-5]。研究顯示，BTSCs與神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)具有許多相似的特性，如自我更新、多向分化及成瘤性等，提示BTSCs可能起源于突變的NSCs[6-8]。探討NSCs向膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSCs)惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制對(duì)于進(jìn)一步明確膠質(zhì)瘤的起源以及開(kāi)發(fā)特異性的治療策略具有十分重要的意義。本研究采用含有29 186個(gè)人類(lèi)mRNA探針的表達(dá)譜基因芯片對(duì)正常NSCs及GSCs中的差異表達(dá)基因進(jìn)行對(duì)比篩查，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)可能與NSCs向GSCs惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)的信號(hào)分子及信號(hào)路徑進(jìn)行預(yù)測(cè)，旨在為探索GSCs的起源及機(jī)制提供新的線(xiàn)索和方向。

1 材料與方法

1.1 人GSCs和NSCs的分離培養(yǎng)及鑒定 GSCs來(lái)源于新診斷的WHO Ⅳ級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)患者手術(shù)切除的腫瘤組織。NSCs來(lái)源于10～13周自然流產(chǎn)胚胎的海馬組織。采用Neurosphere法體外培養(yǎng)擴(kuò)增所獲GSCs和NSCs，在穩(wěn)定傳代的基礎(chǔ)上，對(duì)這兩種干細(xì)胞的表型特征和分化特性進(jìn)行CD133和Nestin免疫化學(xué)染色鑒定，同時(shí)在裸鼠顱內(nèi)進(jìn)行定向移植試驗(yàn)檢測(cè)兩種干細(xì)胞的體內(nèi)成瘤性[9]。本研究經(jīng)海軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，標(biāo)本的獲取均經(jīng)患者本人同意，患者了解所取標(biāo)本的風(fēng)險(xiǎn)和用途，并簽署知情同意書(shū)。

1.2 差異表達(dá)基因的微陣列基因芯片分析 采用RNeasy Midi試劑盒(Qiagen公司，加拿大)提取GSCs和NSCs的總RNA，利用Human HOA5.1 OneArray(Phalanx Biotech Group，中國(guó)臺(tái)灣)對(duì)GSCs和NSCs的mRNA表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)。收集所得數(shù)據(jù)，利用Rosetta Resolved System (Rosetta Biosoftware公司，美國(guó))進(jìn)行分析，根據(jù)所得FC值(GSCs與NSCs中mRNA表達(dá)豐度的比值)確定差異表達(dá)基因，標(biāo)準(zhǔn)為FC≥2或≤0.5且P＜0.01。

1.3 qRT-PCR驗(yàn)證 利用Trizol試劑分別提取體外培養(yǎng)的GSCs和NSCs中的總RNA，根據(jù)待測(cè)mRNA序列設(shè)計(jì)合成引物(表1)，利用SYBR Green 試劑盒(Applied Biosystems)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，以β-actin作為內(nèi)參。擴(kuò)增程序?yàn)?7℃ 3min；95℃變性30s，56℃退火20s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果以2－ΔΔCt表示。

表1 實(shí)時(shí)定量RT-PCR的寡核苷酸引物Tab.1 Oligonucleotide primers in quantitative real-time RT-PCR

1.4 生物信息學(xué)分析 利用GO和KEGG富集分析研究差異表達(dá)基因可能參與的信號(hào)路徑。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，差異表達(dá)基因的比較采用結(jié)合方差分析(ANOVA)和倍數(shù)變化(fold change，F(xiàn)C)分析的方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GBM來(lái)源的GSCs的鑒定 無(wú)菌環(huán)境中分離GBM標(biāo)本成單細(xì)胞懸液，無(wú)血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基體外培養(yǎng)7d，鏡下可見(jiàn)許多小的神經(jīng)球。免疫熒光染色顯示CD133陽(yáng)性。誘導(dǎo)分化后可形成膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)陽(yáng)性的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和β-tubulin陽(yáng)性的神經(jīng)元細(xì)胞。利用動(dòng)物立體定向儀將這些神經(jīng)球移植到裸鼠顱內(nèi)可形成新的腦腫瘤(圖1)。

圖1 GSCs的體外培養(yǎng)及鑒定(×20)Fig. 1 Culture in vitro and identification of GSCs (×20)

2.2 GSCs與NSCs中差異表達(dá)基因的芯片檢測(cè) 微陣列基因芯片檢測(cè)顯示，與NSCs相比，GSCs中有1501個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1372個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。表2顯示了差異表達(dá)最顯著的10個(gè)上調(diào)和下調(diào)基因。對(duì)2873個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類(lèi)分析，篩選條件為FC≥2或者≤1，調(diào)節(jié)P≤0.01，表達(dá)譜中最大值為6.166 69，最小值為－9.349 5，將每個(gè)mRNA在6個(gè)樣本中的最大值標(biāo)準(zhǔn)化為1，最小值轉(zhuǎn)化為0，如圖2。GO及KEGG分析顯示，在1372個(gè)下調(diào)基因中，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)＜0.01的富集的GO生物過(guò)程有139個(gè)，在1501個(gè)上調(diào)基因中，F(xiàn)DR＜0.01的富集的GO生物過(guò)程有62個(gè)。下調(diào)基因中，F(xiàn)DR＜0.01的KEGG信號(hào)路徑有5個(gè)，分別為神經(jīng)軸突導(dǎo)向、細(xì)胞周期、細(xì)胞黏附、免疫炎癥反應(yīng)及癌癥相關(guān)信號(hào)路徑(圖3)。

表2 GSCs中上調(diào)和下調(diào)最明顯的前10個(gè)基因Tab.2 Top 10 up-and down-regulated genes in GSCs

圖2 GSCs及NSCs中差異表達(dá)基因的聚類(lèi)分析Fig. 2 Heatmaps depicting hNSC and hGSC mRNAs derived from t-test and FC analyses

2.3 qRT-PCR驗(yàn)證 本研究選擇7個(gè)芯片檢測(cè)到的差異表達(dá)基因(DCX、PTGS2、SCGN、GAD2、OTX2、PEG10、NRXN3)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，根據(jù)各自mRNA序列設(shè)計(jì)引物，以β-actin作為內(nèi)參照。驗(yàn)證結(jié)果顯示，所選的7個(gè)基因在GSCs與NSCs中均存在差異表達(dá)，且與芯片檢測(cè)結(jié)果相符(表3)，兩種方法檢測(cè)的一致率為100%。

表3 部分芯片檢測(cè)差異基因的實(shí)時(shí)定量RT-PCR驗(yàn)證Tab.3 Assay of some of the differential genes by quantitative real-time RT-PCR

3 討 論

最近有研究顯示，膠質(zhì)瘤中存在一小群稱(chēng)為GSCs的、具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群，該細(xì)胞亞群來(lái)源于突變的NSCs[10-12]，是膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)及放化療抗性的根源。為了進(jìn)一步探索NSCs向GSCs惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制，本研究對(duì)GSCs和NSCs進(jìn)行了表達(dá)譜基因芯片對(duì)比篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2873個(gè)差異表達(dá)基因。其中尼克酰胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(NNMT)在GSCs中的表達(dá)明顯高于NSCs，而有研究顯示NNMT在其他腫瘤細(xì)胞中也呈高表達(dá)，敲除NNMT能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和集落形成能力[13]，提示NNMT的異常表達(dá)可能參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展。相反，性別決定基因盒1(SOX1)在GSCs中的表達(dá)明顯低于NSCs，而本研究所采用的標(biāo)本均來(lái)自男性，因此可以忽略性別因素的影響，從而推測(cè)SOX1表達(dá)缺失可能參與了NSCs向GSCs的惡性轉(zhuǎn)化。有研究證實(shí)肝癌細(xì)胞可通過(guò)啟動(dòng)子的超甲基化而下調(diào)SOX1的表達(dá)，而過(guò)表達(dá)SOX1可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、克隆形成及侵襲能力[14]。

圖3 對(duì)芯片檢測(cè)的差異表達(dá)基因的GO功能和KEGG信號(hào)路徑富集分析Fig. 3 The GO BP and KEGG signaling pathway analysis of differentially expressed genes

然而，本研究中一些差異表達(dá)基因的功能與已有的報(bào)道并不一致，如胰島素樣因子結(jié)合蛋白3(IGFBP3)在GSCs中的表達(dá)明顯高于NSCs，而Wu等[15]的研究顯示IGFBP3可通過(guò)活化caspases誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期休止，提示同一種基因在不同的組織細(xì)胞中可能具有截然不同的功能和作用，盡管有些基因在其他腫瘤中的功能已被研究確定，但是在膠質(zhì)瘤中的作用還有待于進(jìn)一步深入探討。

總之，本研究揭示了GSCs與NSCs在mRNA表達(dá)水平的差異，提示由mRNA所控制的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)對(duì)NSCs向GSCs的惡性轉(zhuǎn)化具有重要影響。該結(jié)果為探索膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了線(xiàn)索，為膠質(zhì)瘤的診斷和靶向治療提供了新的靶點(diǎn)。

[1]Maher EA, Furnari FB, Bachoo RM, et al. Malignant glioma:genetics and biology of a grave matter[J]. Genes Dev, 2001,15(11): 1311-1333.

[2]Rich JN. Cancer stem cells in radiation resistance[J]. Cancer Res, 2007, 67(19): 8980-8984.

[3]Singh SK, Hawkins C, Clarke ID, et al. Identifi cation of human brain tumour initiating cells[J]. Nature, 2004, 432(7015): 396-401.

[4]Galli R, Binda E, Orfanelli U, et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma[J]. Cancer Res, 2004, 64(19): 7011-7021.

[5]Dean M, Fojo T, Bates S. Tumour stem cells and drug resistance[J]. Nat Rev Cancer, 2005, 5(4): 275-284.

[6]Quinones-Hinojosa A, Chaichana K. The human subventricular zone: a source of new cells and a potential source of brain tumors[J]. Exp Neurol, 2007, 205(2): 313-324.

[7]Chaichana KL, Guerrero-Cazares H, Capilla-Gonzalez V, et al.Intra-operatively obtained human tissue: protocols and techniques for the study of neural stem cells[J]. J Neurosci Methods, 2009, 180(1): 116-125.

[8]Calabrese C, Poppleton H, Kocak M, et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells[J]. Cancer Cell, 2007, 11(1): 69-82.

[9]Aboody KS, Brown A, Rainov NG, et al. Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: evidence from intracranial gliomas[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(23):12846-12851.

[10]Alcantara Llaguno S, Chen J, Kwon CH, et al. Malignant astrocytomas originate from neural stem/progenitor cells in a somatic tumor suppressor mouse model[J]. Cancer Cell, 2009,15(1): 45-56.

[11]Bachoo RM, Maher EA, Ligon KL, et al. Epidermal growth factor receptor and Ink4a/Arf: convergent mechanisms governing terminal differentiation and transformation along the neural stem cell to astrocyte axis[J]. Cancer Cell, 2002, 1(3): 269-277.

[12]Holland EC, Hively WP, DePinho RA, et al. constitutively active epidermal growth factor receptor cooperates with disruption of G1cell-cycle arrest pathways to induce glioma-like lesions in mice[J]. Genes Dev, 1998, 12(23): 3675-3685.

[13]Pozzi V, Mazzotta M, Lo Muzio L, et al. Inhibiting proliferation in KB cancer cell by RNA interference-mediated knowdown of nicotinamide N-Methyltransferase expression[J]. Int J Immunopathol Pharmacol, 2011, 24(1): 69-77.

[14]Tsuju K, Yasui K, Gen Y, et al. PEG10 is a probable target for the amplification at 7q21 detected in hepatocellular carcinoma[J].Cancer Genet Cytogenet, 2010, 198(2): 118-125.

[15]Wu C, Liu X, Wang Y, et al. Insulin-like factor binding protein-3 promotes the G1cell cycle arrest in several cancer cell lines[J].Gene, 2013, 512(1): 127-133.