張秀娟，曹慧琪，邢志華，季宇彬*

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心生物安全評(píng)價(jià)研究所，黑龍江哈爾濱 150076;2.國(guó)家教育部抗腫瘤天然藥物教育部工程研究中心，黑龍江哈爾濱 150076;3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150076)

補(bǔ)骨脂是中醫(yī)臨床治療脾腎陽(yáng)虛的常用補(bǔ)虛藥物［1］。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為補(bǔ)骨脂具有補(bǔ)腎助陽(yáng)，固精縮尿，暖脾止瀉，納氣平喘等功效，主治腎虛冷泄，遺尿尿頻，陽(yáng)痿，遺精，虛寒喘咳，腰膝冷痛等病癥［2］;現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明該藥具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，抗菌，抗衰老的作用，對(duì)平滑肌有雙向調(diào)節(jié)作用，以及抗腫瘤等藥理活性［3-4］。補(bǔ)骨脂藥材、炮制、化學(xué)、藥理作用及臨床應(yīng)用等在國(guó)內(nèi)外都有了多方面的研究報(bào)道，但是長(zhǎng)期使用補(bǔ)骨脂對(duì)機(jī)體損傷方面的研究甚少。故本課題旨在通過(guò)觀察肝臟病理組織、血清學(xué)、細(xì)胞學(xué)變化規(guī)律，分析補(bǔ)骨脂對(duì)小鼠肝損傷作用，并探討其安全用量范圍，為今后安全、合理、有效用藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥物 補(bǔ)骨脂購(gòu)自哈爾濱人民同泰藥店，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院金哲雄教授鑒定為豆科補(bǔ)骨脂屬植物補(bǔ)骨脂Psoralea corylifolia的干燥成熟果實(shí)。

1.2 動(dòng)物 昆明種小鼠 (20±2)g，雌雄各半，合格證為黑動(dòng)字第POO101006號(hào)，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 試劑與儀器 谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒、白細(xì)胞介素-6(IL-6)試劑盒，南京建成生物工程研究所;Adventurer萬(wàn)分之一電子天平，OHAUS公司;高速離心機(jī)，Beckman Coulter;超細(xì)勻漿器，德國(guó)FLUKU F6/10;低速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠 LD4-2A;SUNRISE酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司;流式細(xì)胞儀，美國(guó)BECK-COULTER公司;OLYMPUS IX70倒置顯微鏡，Olympus公司。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 小鼠40只，隨機(jī)分成4組，分別為對(duì)照組、補(bǔ)骨脂組 (6.0、3.0、1.5 g/kg)，灌胃，28 d。

2.2 補(bǔ)骨脂對(duì)小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響 取小鼠肝臟適量切成小塊，PBS沖洗，石蠟包埋，H.E.染色。

2.3 補(bǔ)骨脂對(duì)小鼠血清ALT、AST的影響 眼球取血，3000 r/min離心10 min，分離血清，紫外分光光度法測(cè)定ALT、AST活性。

2.4 補(bǔ)骨脂對(duì)小鼠血清TNF-α、IL-6活性的影響 眼球取血，3000 r/min離心10 min，分離血清，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定TNF-α、IL-6活性。

2.5 補(bǔ)骨脂對(duì)小鼠肝細(xì)胞線粒體膜電位的影響

2.5.1 肝細(xì)胞的分離純化 小鼠肝臟適量切成小塊，PBS沖洗，胰酶37℃消化15 min，小牛血清中止，300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，1000 r/min，10 min，棄上清，收集沉淀細(xì)胞，1000 r/min離心10 min，棄上清，調(diào)整細(xì)胞密度約為1×106個(gè)/mL。

2.5.2 線粒體膜電位的測(cè)定 取500 μL細(xì)胞懸液，加染色液500 μL，使其終質(zhì)量濃度為10 μg/mL，37℃孵育30 min，加1 mL PBS，1000 r/min離心10 min，棄上清，加1 mL PBS，300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾到流式管中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)630 nm。

2.6 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析。所有數(shù)據(jù)用表示，數(shù)據(jù)分析用方差檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)骨脂對(duì)小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響 如圖1所見，對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，匯管區(qū)無(wú)擴(kuò)大，肝索排列整齊，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，無(wú)腫大、脂變、壞死及明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn);補(bǔ)骨脂各組則出現(xiàn)肝細(xì)胞輕度病變，1.5 g/kg組發(fā)現(xiàn)少量小壞死病灶;3.0 g/kg組不僅出現(xiàn)小壞死灶，且有肝細(xì)胞腫脹現(xiàn)象;6.0 g/kg組組織切片顯示為小壞死灶增多。

圖1 補(bǔ)骨脂對(duì)小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響 (40×10)

3.2 補(bǔ)骨脂對(duì)小鼠血清ALT、AST的影響 6.0、3.0 g/kg組ALT和AST活性與對(duì)照組相比均有顯著的上升，說(shuō)明補(bǔ)骨脂對(duì)小鼠肝功能具有明顯的損傷作用。見表1。

表1 補(bǔ)骨脂對(duì)小鼠血清ALT和AST活性的影響 )

表1 補(bǔ)骨脂對(duì)小鼠血清ALT和AST活性的影響 )

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組 別 劑量/(g·kg－1)動(dòng)物數(shù)/只ALT/(U·L－1)AST/(U·L－1)－ 10 31.8±4.93 57.7±8.97補(bǔ)骨脂組 1.5 9 41.5±3.63 67.5±9.55補(bǔ)骨脂組 3 8 46.2±7.90* 75.6±8.79*補(bǔ)骨脂組 6 8 66.5±8.64＊＊ 93.0±5.33對(duì)照組＊＊

3.3 補(bǔ)骨脂對(duì)小鼠血清TNF-α、IL-6活性的影響 與對(duì)照組比較，TNF-α活性6.0 g/kg組顯著升高;6.0、3.0 g/kg組IL-6活性與對(duì)照組相比均顯著升高，說(shuō)明補(bǔ)骨脂對(duì)小鼠肝功能具有明顯的損傷作用。見表2。

表2 補(bǔ)骨脂對(duì)小鼠血清 TNF-α和 IL-6活性的影響

表2 補(bǔ)骨脂對(duì)小鼠血清 TNF-α和 IL-6活性的影響

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組 別 劑量/(g·kg －1)動(dòng)物數(shù)/只TNF-α/(U·L －1)IL-6/(U·L －1)對(duì)照組 － 10 37.4±5.68 25.9±0.975補(bǔ)骨脂組 1.5 10 53.5±10.7 28.6±2.65補(bǔ)骨脂組 3 9 59.8±9.60 31.1±1.28*補(bǔ)骨脂組 6 8 101.5 ±24.5＊＊ 42.7±3.07＊＊

3.4 補(bǔ)骨脂對(duì)小鼠肝細(xì)胞線粒體膜電位的影響 如圖2所示。肝細(xì)胞中強(qiáng)熒光部分細(xì)胞所占百分比逐漸減少，隨著藥物劑量的升高其比例的減少更加顯著，并呈一定的劑量依賴關(guān)系，說(shuō)明補(bǔ)骨脂可使小鼠肝細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位明顯下降，致肝細(xì)胞損傷。

圖2 補(bǔ)骨脂對(duì)小鼠肝細(xì)胞線粒體Δψm的影響

4 討論

中藥肝毒性研究已成為中醫(yī)藥界關(guān)注熱點(diǎn)問(wèn)題，正確合理的評(píng)價(jià)中藥毒性已成為當(dāng)今中藥研究領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。進(jìn)入機(jī)體的各種外源物質(zhì)最終都會(huì)在肝臟內(nèi)代謝、轉(zhuǎn)化、貯留，可直接或通過(guò)代謝作用間接損害肝臟，誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死、炎癥等病理改變，造成急性、慢性等不同程度的肝臟疾?。?-6］。外源性刺激引起動(dòng)物肝臟發(fā)生損傷時(shí)均可引起血清轉(zhuǎn)氨酶活性的升高［7-8］，其中血清 ALT及AST水平可在一定程度上反應(yīng)肝臟的功能狀態(tài)。細(xì)胞因子是機(jī)體防御系統(tǒng)的主要部分，外界條件刺激會(huì)對(duì)各種細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生促進(jìn)作用，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì) (TNF-α、IL-6)釋放［9-11］，產(chǎn)生過(guò)多亦可損傷肝細(xì)胞。正常情況下，線粒體跨膜電位是維持線粒體進(jìn)行氧化磷酸化、產(chǎn)生三磷酸腺苷的先決條件，是線粒體發(fā)揮正常功能的基礎(chǔ)。線粒體不僅可以通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生三磷酸腺苷 (ATP)為機(jī)體供能外，還具有很多其他重要功能，如參與細(xì)胞內(nèi)鈣自穩(wěn)平衡、pH值的調(diào)節(jié)等，特別在細(xì)胞生存和壞死的調(diào)控中起決定性功能，細(xì)胞壞死時(shí)線粒體的形態(tài)和功能發(fā)生一系列變化［12-13］。研究結(jié)果顯示補(bǔ)骨脂能引起小鼠肝細(xì)胞腫脹、壞死，血清學(xué)結(jié)果顯示，ALT、AST活性低劑量組較空白組有增加趨勢(shì)但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高、中劑量組顯著增加;TNF-α、IL-6活性低劑量組較空白組有增加趨勢(shì)但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高、中劑量組顯著增加;肝細(xì)胞線粒體膜電位 (ΔΨm)隨著給藥劑量的增加顯著降低。說(shuō)明補(bǔ)骨脂對(duì)小鼠肝臟具有明顯的損傷作用。

綜上所述，補(bǔ)骨脂經(jīng)長(zhǎng)期大劑量給藥對(duì)小鼠體質(zhì)量、肝組織、肝功能酶都有明顯的影響，而且對(duì)肝細(xì)胞有損傷作用，表現(xiàn)為引起肝細(xì)胞線粒體膜電位顯著下降，肝細(xì)胞壞死。提示補(bǔ)骨脂大劑量使用可對(duì)小鼠肝臟造成一定的損害。

［1］吳 疆，魏 巍，袁永兵.補(bǔ)骨脂的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展［J］.藥物評(píng)價(jià)研究，2011，34(3):217-219.

［2］劉自力，施 靜.補(bǔ)骨脂臨床研究進(jìn)展［J］.臨床分析與研究，2009，18(5):101-102.

［3］曹金一，劉京晶，黃文華，等.補(bǔ)骨脂藥理作用與臨床應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.中藥藥理與臨床，2008，24(6):89-91.

［4］劉 樺，白焱晶，陳亞云，等.中藥補(bǔ)骨脂化學(xué)成分的研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2008，33(12):1410-1412.

［5］王京麗，周超凡.中草藥及其制劑對(duì)肝損傷的研究概述［J］.中國(guó)中藥雜志，2011，36(23):3371-3373.

［6］劉樹民.中藥藥物性肝損害［M］.北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2007:53-59.

［7］賈毅捷，王育琴，常紅軍，等.77例中藥不良反應(yīng)報(bào)告與分析［J］.藥物不良反應(yīng)雜志，2003，5(4):231-234.

［8］陳一凡，蔡皓東.中藥引起肝損害的調(diào)查分析［J］.藥物不良反應(yīng)雜志，1999(1):27-32.

［9］陳 晨，王 蓓，余 黎，等.中藥肝毒性成分研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)與臨床研究，2012，20(2):148-151.

［10］Neuman M G.Cytokines-central factors in alcoholic liver disease［J］.Alcohol Res Health，2003，27(4):307-316.

［11］Gobejishvili L，Barve S，Joshi-Barve S，et al.Chronic ethanolmediated decrease in cAMP primes macrophages to enhanced LPS-inducible NF-kappa B activity and TNF expression:relevance to alcoholic liver disease［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2006，291(4):681-688.

［12］王君明，崔 瑛，申玲玲，等.中藥致藥源性肝損傷的氧化應(yīng)激機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(5):247-249

［13］Ichas F，Mazat J P.From calcium signling to cell death:two conformations for the mitochondrial permeability transition pore，switching from low-to high-conductance state［J］.Biochim Biophys Acta，1998，1366(1/2):33-50.