孔慶明，姚亞波，陳睿，陸紹紅

浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院寄生蟲病研究所，浙江 杭州 310013

近年來，抗體技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于疾病的診治領(lǐng)域，新型基因工程抗體不斷出現(xiàn)，抗體小型化是抗體基因工程的主要研究方向之一。最新的單域抗體 (Single domain antibody，SdAb)是指保留了較好的抗原結(jié)合能力和專一性的VH小分子抗體片段，結(jié)構(gòu)簡單，容易進(jìn)行體外規(guī)?；铣杀磉_(dá)。SdAb體積約為完整抗體的1/12，具有較強(qiáng)的組織穿透能力，利于它們進(jìn)入致密的組織以及穿透血腦屏障。這使它容易接近靶目標(biāo)表面的溝、縫或被隱藏的抗原表位，識(shí)別許多傳統(tǒng)抗體無法識(shí)別的抗原。然而，SdAb暴露了表面疏水基團(tuán)，非特異性吸附增加，易凝結(jié)和黏附，須經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后才能使用。1989年，布魯塞爾自由大學(xué)的Muyldermans偶然發(fā)現(xiàn)駱駝血液中有半數(shù)的抗體是天然缺失輕鏈。4年后，與其導(dǎo)師Hamers教授在Nature發(fā)文闡明了該類重鏈抗體特性[1]。源于駱駝的 SdAb，即納米抗體 (Nanobody，Nb)，相對(duì)分子質(zhì)量小于15 kDa，其內(nèi)部存在二硫鍵，表面有大量親水殘基，對(duì)熱和 pH值有較強(qiáng)的抵抗力。具有常規(guī)單域抗體無法比擬的水溶性和構(gòu)象穩(wěn)定性[2-4]。這種單體結(jié)構(gòu)域能高特異性、高親和力地與抗原結(jié)合，從而中和或封閉相對(duì)隱蔽的抗原表位[2,5-7]。憑借以上特性，Nb較之常規(guī)單域抗體受到了更加廣泛的關(guān)注和認(rèn)可。隨著1994年第一個(gè) Nb的氨基酸序列測(cè)定以后，便進(jìn)入了對(duì)Nb結(jié)構(gòu)、特性[3-4,8-15]和生產(chǎn)、應(yīng)用[16-23]的探索與開發(fā)研究階段 (圖 1)。納米抗體技術(shù)的研發(fā)必將大大提高人類疾病的診斷水平。在 Nb領(lǐng)域已經(jīng)有很多優(yōu)秀綜述，從不同方面介紹 Nb的研究應(yīng)用進(jìn)展。本文主要從診斷檢測(cè)角度出發(fā)，在介紹Nb領(lǐng)域的最新進(jìn)展之外，分析該領(lǐng)域技術(shù)上存在的問題，并提出積極的解決方案。

圖1 納米抗體及其在診斷檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展路線圖Fig. 1 Roadmap of Nb advancements and its application in diagnosis and detection.

1 納米抗體的制備及其分子特征

1.1 納米抗體的制備

通過免疫學(xué)和基因工程等技術(shù)，從駱駝體內(nèi)分離出重鏈抗體 (Heavy chain antibodies，HCAbs)，提取總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得模板。根據(jù)重鏈抗體保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，經(jīng) PCR法擴(kuò)增獲得全套重鏈抗體可變區(qū)基因 (Viriable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)，而后將其克隆至載體，體外表達(dá)獲得含有多種單價(jià)Nb的抗體庫。應(yīng)用特異性抗原從Nb庫中經(jīng)過多次淘選即可得到抗原特異的Nb[24-26](圖2)。與常規(guī)抗體庫相比，Nb庫的構(gòu)建更為簡單、有效。通常僅用一對(duì)簡并引物擴(kuò)增就足以獲得駱駝重鏈抗體的全套VHH基因，經(jīng)過3?4輪富集篩選后即可分析單個(gè)克隆以獲得目的抗體。Nb源于天然缺失輕鏈的重鏈抗體，天然存在，穩(wěn)定性和可溶性更強(qiáng)；且具有很強(qiáng)的抗原結(jié)合能力，能夠識(shí)別傳統(tǒng)抗體無法識(shí)別的隱蔽表位或小表位。

Nb的制備與篩選常用的為噬菌體天然抗體庫和抗原傾向性抗體庫兩類。Nb的親和力、特異性等分子特征的優(yōu)劣取決于噬菌體抗體庫的庫容和多樣性兩大因素。天然抗體庫是從未經(jīng)免疫的駱駝B淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增得到抗體的V區(qū)基因，隨后重組到噬菌體中形成的抗體庫。如此得到的抗體特異性相對(duì)較低，而且只有庫容足夠大(109–1010)時(shí)才可能篩選到高親和力的抗體?？乖瓋A向性抗體庫的庫容量比天然庫低，但抗體庫中能夠識(shí)別特定抗原的特異性功能抗體較高，易于篩選到高親和力的目的抗體。比如，A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素 (Botulinum neurotoxin serotype A，BoNT A)免疫美洲鴕5次，每次間隔3周。多次淘選后得到血清型特異的 Nb。液相芯片及表面等離子體共振技術(shù)分析Nb的結(jié)合動(dòng)力學(xué)，兩者的解離常數(shù)在 2.2×10–11–1.6×10–10mol/L 之間。如此高的抗原結(jié)合能力有助于 A型肉毒素現(xiàn)場(chǎng)快速篩查與檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)研究[27]。然而，該類庫的最大缺陷在于對(duì)每一個(gè)新抗原都必須重新建庫，工作量比較大。納米抗體庫多樣性的分子基礎(chǔ)源于駱駝重鏈V區(qū)胚系基因片段V、D和J在CDR3結(jié)構(gòu)域隨機(jī)位點(diǎn)處的組合性重排。對(duì)于天然抗體庫和抗原傾向性抗體庫，重排和位點(diǎn)變異的不可控性以及建庫過程中轉(zhuǎn)化效率不高的因素，一般很難得到具有豐富多樣性和較大庫容(109以上)的納米抗體庫。基于三聯(lián)核苷酸突變技術(shù) (Trinucleotide mutagenesis，TRIM)的合成或半合成抗體庫以及體外翻譯為基礎(chǔ)的核糖體展示抗體庫的出現(xiàn)，克服了常規(guī)噬菌體抗體庫的庫容與多樣性的局限。由于不需要轉(zhuǎn)染步驟，因此可獲得大容量的文庫 (1011–1015)。核糖體展示技術(shù)也能通過PCR易錯(cuò)、DNA改組和交錯(cuò)延伸等方法形成大量突變體庫，易于達(dá)到多樣性。與常規(guī)噬菌體抗體庫所制備的抗體親和力(10–7–10–8mol/L)相比，核糖體展示系統(tǒng)可以將抗體的親和力提高至10–12mol/L的水平。

1.2 納米抗體的分子特征

駱駝源重鏈抗體的VHH和人源抗體的VH結(jié)構(gòu)非常相似，包含3個(gè)高變區(qū)和其兩側(cè)的4個(gè)骨架區(qū)。VHH由2個(gè)β片層形成支架，3個(gè)高變區(qū)聚集在一側(cè)參與抗原識(shí)別。比較發(fā)現(xiàn)駱駝的VHH胚系基因序列和人類VH3家族序列高度同源，不同之處在于VHH的互補(bǔ)決定區(qū)1 (Complementaritydetermining region 1，CDR1)和CDR3比人的稍長，而且其 CDR3形成凸形的結(jié)構(gòu)，能更好地結(jié)合抗原，這在一定程度上彌補(bǔ)了輕鏈缺失造成的抗原結(jié)合力下降的不足[28]，從而提高了其對(duì)抗原結(jié)合的特異性和親和力。VHH表面只有 10個(gè)氨基酸與人VH不同。另外，在框架區(qū)2 (Framework region 2，F(xiàn)R2)位置有4個(gè)特異的親水氨基酸 (位點(diǎn)37、44、45、47)[29]替代了 VH 相應(yīng)位點(diǎn)疏水的氨基酸(圖3)。這些親水殘基能使VHH保持嚴(yán)格的單體結(jié)構(gòu)而不易發(fā)生自身聚集。

圖3 VHH與VH結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 3 Structure scheme of VHH and VH.

Nb沒有傳統(tǒng)抗體的Fc段，從而也避免了補(bǔ)體反應(yīng)。而且Nb對(duì)人體的免疫原性較弱，生物相容性較好，因此可通過基因工程技術(shù)進(jìn)行CDR移植或者表面重塑，即選用與人單域抗體表面殘基相似的氨基酸替換使其人源化。Nb表面重塑設(shè)計(jì)時(shí)，要兼顧FR2位置4個(gè)特異氨基酸的親水性以及對(duì)抗體分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的功能。位點(diǎn) 37與47處的氨基酸替換會(huì)影響抗體分子的穩(wěn)定性，或者降低對(duì)抗原特異性結(jié)合的能力；位點(diǎn) 44與45處的氨基酸替換能增加抗體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[30]。因此，在減少Nb異源性改造的基礎(chǔ)上，要兼顧Nb原有的親水性、穩(wěn)定性等抗體活性。

為了進(jìn)一步改善Nb活性，比如提高親和力，延長半衰期等，可以通過短小的連接序列 (Linker)將單價(jià) Nb聚合在一起，轉(zhuǎn)換成多價(jià)或多特異性的 Nb[31]，也能夠攜帶某些特定結(jié)構(gòu)形成融合的Nb[29,32](圖4)。多價(jià)Nb是識(shí)別同一種表位的單價(jià)Nb的聚合物，比單價(jià)Nb具有更高的抗原親和力；多特異性 Nb是識(shí)別不同表位的單價(jià) Nb的聚合物，能結(jié)合不同靶目標(biāo)或同一靶目標(biāo)的不同表位，即使單個(gè)Nb對(duì)其抗原的親和力不高，但2個(gè)或以上 Nb能同時(shí)與自己的抗原表位結(jié)合 (螯合作用)，這就增強(qiáng)了對(duì)靶目標(biāo)的選擇力，效果明顯好于多價(jià)單特異性Nb。值得注意的是在構(gòu)建多價(jià)或多特異性 Nb時(shí)，不同長度的連接肽以及所連接的不同表位 Nb的前后方向會(huì)直接影響對(duì)抗原的特異性結(jié)合能力。比如通過9個(gè)甘氨酸絲氨酸殘基連接的呼吸道合胞體病毒 (Respiratory Syncytial Virus，RSV)雙特異性納米抗體 RSVD3/E4(9GS)微量中和 RSV病毒的能力是RSV-E4/D3(9GS)的 17 倍，IC50為 6 nmol/L[31]。融合的Nb是指通過基因工程技術(shù)將Nb與其他結(jié)構(gòu)結(jié)合形成的融合分子，如酶、抗菌肽、能延長其半衰期的物質(zhì)或介入放射學(xué)中常用的造影劑等。在新的融合分子中，Nb靶向結(jié)合抗原分子，與其融合的部分就能發(fā)揮相應(yīng)的功能。比如將腫瘤壞死因子特異性Nb和半衰期較長的白蛋白特異Nb融合，其血液半衰期明顯延長，同時(shí)也提高了小鼠關(guān)節(jié)炎模型中對(duì)炎癥關(guān)節(jié)的靶向性[33]。

圖4 納米抗體的類型Fig. 4 Types of nanobody.

2 納米抗體在疾病檢測(cè)診斷中的應(yīng)用

2.1 納米抗體在疾病體外檢測(cè)中的應(yīng)用

Nb具有較強(qiáng)的表位識(shí)別與結(jié)合能力，其構(gòu)建及表達(dá)過程甚至不需要純化的抗原。Nb嬌小的個(gè)體 (直徑2.5 nm×高度4 nm)，使其能夠以高密度牢固地結(jié)合于固相載體捕捉微量抗原。這些特性是常規(guī)單抗甚至單域抗體所不及的。因此，可以充分發(fā)揮以Nb為基礎(chǔ)的免疫檢測(cè)方法的作用，檢測(cè)與鑒別臨床上較難檢出的靶點(diǎn)以及外來病原物或毒素。

Nb能夠以高密度牢固地結(jié)合于固相載體，并且具有避開復(fù)雜樣本中的干擾因素結(jié)合更多配體的能力。而且，固態(tài)載體上的 Nb很適合捕捉微量抗原。前列腺特異性抗原 (Prostatespecific antigen，PSA)對(duì)前腺癌的診斷特異性達(dá)90%–97%，被廣泛應(yīng)用于前列腺癌的篩選、診斷及治療后的監(jiān)測(cè)。健康男性，釋放入血中的PSA濃度很低，一般小于 4 ng/mL。PSA特異性的納米抗體cAbPSA-N7 (15 kDa)固定在以金為基底材料形成的烷基硫醇自組裝單層膜上的濃度可達(dá)28 fmol/mm2，血清中低于10 ng/mL的PSA均可被直接檢測(cè)到。此法使用抗體捕獲法進(jìn)行檢測(cè)，引入親-鏈霉素和膠體金顆粒顯色的三明治放大系統(tǒng)檢測(cè)方法后，以 cAbPSA-N7為基礎(chǔ)的 PSA的檢測(cè)靈敏度能夠達(dá)到 1 ng/mL[34]，能夠?qū)崿F(xiàn)前列腺癌的早期檢測(cè)。另外，Saerens等發(fā)現(xiàn) PSA特異性Nb能區(qū)別不同亞型的PSA[35]，如此更有助于前列腺癌的分期。中毒性休克綜合征毒素-1(Toxic-shock syndrome toxin 1，TSST-1)是由I群金黃色葡萄球菌分泌的胞外致熱性超抗原，是致熱外毒素 C和腸毒素 F二者的統(tǒng)稱。痕量的TSST-1即可導(dǎo)致多種免疫分子過度合成和釋放，進(jìn)而引發(fā)病癥。以TSST-1特異Nb為基礎(chǔ)的免疫檢測(cè)，可以增強(qiáng)檢出靈敏度。豬血中加入4 ng/mL的 TSST-1，經(jīng)免疫親合色譜分析，超過 96%的TSST-1可以通過特異Nb免疫吸附去除。這為進(jìn)一步開發(fā)高效的免疫吸附產(chǎn)品，去除敗血癥動(dòng)物或人血液中的毒素超抗原，創(chuàng)造了基礎(chǔ)條件[36]。

Nb制備不需要純化的抗原以及其較強(qiáng)的表位識(shí)別能力等特性可應(yīng)用于錐蟲病的特異性鑒定。Nb的小分子特性使其能特異性結(jié)合到錐蟲涎傳亞屬表面抗原相對(duì)保守但卻隱蔽的位點(diǎn)，這是常規(guī)單抗較大的抗原識(shí)別臂無法做到的。Saerens等以伊氏錐蟲免疫駱駝制備了特異的納米抗體，有利于蘇拉病的高靈敏度檢出[37]。Nb的表位識(shí)別能力還可以應(yīng)用于帶絳蟲屬下各種間的區(qū)分和鑒定。帶絳蟲屬下有鏈狀帶絳蟲、肥胖帶絳蟲和亞洲帶絳蟲3個(gè)種。三種帶絳蟲形態(tài)上較為相似難以區(qū)分，臨床上以鏈狀絳蟲對(duì)人類造成的危害為重?；趩慰沟拿嘎?lián)免疫吸附技術(shù)盡管可以特異靈敏地檢測(cè)鏈狀帶絳蟲，然而卻無法與其他種相區(qū)分。鏈狀絳蟲特異的Nb可以識(shí)別鏈狀絳蟲特異抗原Ts14，而不與肥胖帶絳蟲等發(fā)生交叉反應(yīng)[38]，這種高特異性的表位識(shí)別能力使絳蟲病的種間鑒定成為可能，有望發(fā)展為種特異性抗原檢測(cè)的新方法。

膠體金標(biāo)記技術(shù)是繼酶免疫標(biāo)記和放射性免疫標(biāo)記等之后的又一較為成熟的免疫標(biāo)記技術(shù)。1989–1990年，Spielberg和Beggs等在前人研究的基礎(chǔ)上，分別建立了斑點(diǎn)金免疫滲濾和膠體金免疫層析法，并最先應(yīng)用于檢測(cè)人血清及尿液中的HCG[39-40]。然而，由于常規(guī)單抗較大 (分子量約150 kDa，大小約15 nm)，與膠體金顆粒(常規(guī)應(yīng)用大小為 5–50 nm)偶聯(lián)的效率相對(duì)較低。隨著具有高親和力、特異性的抗原結(jié)合能力的Nb (分子量小于15 kDa，大小約3 nm)制備技術(shù)的興起，相信免疫膠體金技術(shù)將逐漸得到完善和成熟。常規(guī)的膠體金標(biāo)記抗體一般采用靜電吸附或化學(xué)偶聯(lián)的方式。其中，化學(xué)偶聯(lián)方式中又以Au-S鍵或碳二亞胺鹽酸鹽/羥基琥珀酰亞胺形成酰胺鍵偶聯(lián)為主。上述化學(xué)偶聯(lián)方式均需對(duì)金顆?；蛘叩鞍妆砻孢M(jìn)行相應(yīng)的化學(xué)修飾，比如金納米粒子表面的羧基修飾以及抗體分子表面的半胱氨酸基序修飾等，同時(shí)也增加了應(yīng)用成本。Nb體外基因工程生產(chǎn)制備過程中，可以將與金屬顆粒偶聯(lián)的殘基直接引入抗體片段。某種程度上既節(jié)約了成本也提高了偶聯(lián)的效率。比如，Hattori等通過重疊PCR將金顆粒連接多肽(Gold-binding peptide，LKAHLPPSRLPS)重組至Nb基因組中，既實(shí)現(xiàn)了Nb與金顆粒的高親和力特異性結(jié)合，又簡化了Nb純化的步驟，同時(shí)也節(jié)約了Nb的制備和標(biāo)記成本[41]。

值得注意的是Nb結(jié)合固相載體的密度與其活性位點(diǎn)的有效性這一矛盾問題。Nb的小體積決定了其空間位阻也較小，因而可以高密度地結(jié)合于固相載體。這雖然有利于檢測(cè)靈敏度的提高，然而，Nb的這種高密度結(jié)合特性也致使其與抗原結(jié)合的有效CDRs等活性結(jié)構(gòu)域的數(shù)目降低。比如，PSA特異的納米抗體cAbPSA-N7能夠以28 fmol/mm2的高密度結(jié)合于固相載體，以其為基礎(chǔ)的血清中 PSA的免疫檢測(cè)閾值也低于10 ng/mL。然而，高密度結(jié)合于固相載體上的真正可結(jié)合PSA的活性位點(diǎn)只有30%[34]。如果能更好地優(yōu)化協(xié)調(diào)Nb結(jié)合密度與活性位點(diǎn)之間的關(guān)系，相信會(huì)有更高靈敏度的檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)。

隨著Nb制備技術(shù)的日益成熟以及各種標(biāo)記新技術(shù)的不斷出現(xiàn)和完善，相信以Nb為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫和免疫膠體金等體外快速檢測(cè)技術(shù)，從基礎(chǔ)研究走向現(xiàn)場(chǎng)或者床邊檢測(cè) (Point of care testing，POCT)的應(yīng)用將會(huì)很快實(shí)現(xiàn)。

2.2 納米抗體在疾病體內(nèi)無創(chuàng)傷診斷中的應(yīng)用

Nb與靶點(diǎn)結(jié)合的高親合力、高特異性和優(yōu)良的組織穿透能力，使其可以被用作靶向示蹤分子進(jìn)行特異的放射免疫顯像或靶向超聲造影。因此，以Nb為基礎(chǔ)的病灶組織特異的靶向示蹤成為分子成像領(lǐng)域重要的研究方向。

放射免疫顯像是指將放射性核素通過一定方法標(biāo)記到抗體上，利用抗體與抗原的免疫結(jié)合，特異定位到表達(dá)一定抗原的病灶組織上，通過核素發(fā)出的射線進(jìn)行腫瘤特異性顯像。Gainkam等通過小鼠皮下接種皮膚鱗癌細(xì)胞A431 (表皮生長因子受體表達(dá)陽性)建立腫瘤模型，而后靜脈注射放射性金屬標(biāo)記的表皮生長因子受體 (Epidermal growth factor receptor，EGFR)特異性納米抗體99mTc-7C12。注射后 1 h，99mTc-7C12可以借助抗原 (皮膚鱗癌細(xì)胞)與納米抗體 7C12的特異性結(jié)合逐漸濃聚在腫瘤內(nèi)部。通過高分辨的微型計(jì)算機(jī)斷層成像及針孔單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像定量分析表明，相比正常組織對(duì)顯像劑的吸收值(1.16±0.14)%IA/cm3，99mTc-7C12呈現(xiàn)出較高的腫瘤攝取值(4.55±0.24)%IA/cm3。由于 Nb體積小，99mTc-7C12對(duì)腫瘤滲透力強(qiáng)，血中清除速度快，因此可用于癌癥的早期輔助診斷[42]。人表皮生長因子受體-2 (Human epidermal growth factor receptor 2，HER2)是迄今為止乳腺癌中研究較為透徹的基因之一，是乳腺癌發(fā)生發(fā)展、診斷治療及預(yù)后評(píng)價(jià)的重要靶點(diǎn)。Vaneycken等通過酶聯(lián)免疫親和，表面等離子體共振和流式細(xì)胞等技術(shù)分析顯示，HER2特異的納米抗體 2Rs15d可以作為一種新的免疫成像示蹤分子。放射性核素99mTc通過三羰基锝[99mTc(H2O)3(CO)3]+在 50 ℃孵育90 min的方法標(biāo)記2Rs15d，純化后的標(biāo)記復(fù)合物靜脈注射入乳腺癌模型裸鼠體內(nèi)，1 h后針孔單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層影像定量與體內(nèi)分布分析顯示，99mTc-2Rs15d在模型裸鼠腫瘤部位具有較高的特異性的腫瘤攝取值以及快速的血液清除特性，提示2Rs15d可以進(jìn)一步發(fā)展為乳腺癌臨床分子成像診斷的靶向示蹤分子[43]。以上基礎(chǔ)研究顯示了以Nb為基礎(chǔ)的放射免疫成像在疾病的早期檢測(cè)診斷中的廣闊應(yīng)用前景。然而，基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)際應(yīng)用還有一定差距。目前，需要改進(jìn)的是Nb與放射性核素的標(biāo)記技術(shù)，主要涉及到生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和化學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域。成功的標(biāo)記主要依賴于放射性核素、標(biāo)記方法的選擇等因素。放射性核素的種類非常多，在選擇用于放免顯像的核素時(shí)，從與Nb的配伍標(biāo)記角度出發(fā)，一般要考慮兩個(gè)因素：1)核素合理的物理半衰期；Nb定位到病灶組織是一個(gè)生物過程，如果使其在靶部位的濃積和在正常組織的背景之比達(dá)到最大，需要一定的時(shí)間。由于Nb的半衰期較短，一般在十幾分鐘至幾小時(shí)不等[42-45]。因此，核素的半衰期不能過短。但是，使用半衰期過長的核素又會(huì)給病人帶來不必要的輻射。一般認(rèn)為，半衰期在6–200 h比較合適。2)核素應(yīng)為無載體形式；Nb的氨基酸構(gòu)成一般不足 140個(gè)，其與核素結(jié)合的特定位點(diǎn)有限。因此，只有無載體形式的核素才能得到具有高比活度的標(biāo)記抗體，這也是獲得良好顯像的前提。目前，131I、111In和99mTc是研究和應(yīng)用最多的3個(gè)核素。近年來，由于背景清除較快的Nb等小分子抗體的引入以及新的標(biāo)記方法的采用，99mTc半衰期較短的問題也逐漸被克服，因此，其在核醫(yī)學(xué)研究中的使用也最多。放射性核素標(biāo)記抗體的方法分為直接和間接法。直接標(biāo)記法是放射性核素直接與抗體分子形成價(jià)鍵結(jié)合而實(shí)現(xiàn)標(biāo)記。這種標(biāo)記方法步驟簡單，易于實(shí)現(xiàn)，但能用于直接標(biāo)記法的核素有限。間接標(biāo)記法則是通過聯(lián)接劑將核素標(biāo)記在抗體之上，使用的雙功能聯(lián)接劑分為多元胺基羧酸類，如乙二胺四乙酸 (Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(Diethylene triamine pentacetic acid，DTPA)、三乙四胺六乙酸 (Triethylene tetramine hexaacetic acid，TTHA)等；大環(huán)類配體，如四氮雜環(huán)十四烷四乙酸 (1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecane-1,4,8,11-tetraacetic acid，TETA)、三氮雜環(huán)壬烷三乙酸(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid，NOTA)、四氮雜環(huán)十二烷四乙酸(1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid，DOTA)等；含硫氮配體，如二硫二氮N2S2、四硫二氮N2S4等。在保持Nb免疫括性的前提下，提高標(biāo)記率和標(biāo)記物的穩(wěn)定性至關(guān)重要，因?yàn)樗苯佑绊懼鴺?biāo)記物的生物分布和體外顯像質(zhì)量。Xavier等采用68Ga標(biāo)記納米抗體2Rs15d，優(yōu)化標(biāo)記后的復(fù)合物無需純化即可用于乳腺癌的顯像檢測(cè)[44]。2Rs15d與NOTA耦合后與核素68Ga室溫孵育5 min，能夠?qū)崿F(xiàn)納米抗體2Rs15d的快速有效標(biāo)記。(68)Ga-NOTA-2Rs15d 的標(biāo)記率可達(dá)97%以上，放射性比活度在55–200 MBq/nmol。

靶向超聲造影是指將特異性抗體或配體連接到超聲造影劑表面，使其能主動(dòng)地與病變組織上相應(yīng)的抗原或受體靶向結(jié)合，并通過超聲造影技術(shù)顯示靶灶部位分子水平病理變化，從而產(chǎn)生特異性的分子顯像。Hernot等通過親和素橋連構(gòu)建了血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1 (Vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)特異性納米抗體靶向的超聲微泡 μB-cAbVCAM1-5。體外動(dòng)態(tài)的流場(chǎng)實(shí)驗(yàn)分析顯示，納米抗體 cAbVCAM1-5可以在5 dynes/cm2強(qiáng)力的急流場(chǎng)中結(jié)合VCAM-1。體內(nèi)靶向結(jié)合實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建好的微泡 μB-cAbVCAM1-5靜脈注射MC38腫瘤細(xì)胞移植小鼠，10 min后測(cè)定腫瘤處的回聲強(qiáng)度，結(jié)果顯示腫瘤處的回聲明顯增強(qiáng)，與對(duì)照組比具有顯著性差異[46]。流式細(xì)胞分析證實(shí)每 μm2微泡表面可以結(jié)合 104個(gè)納米抗體，由于納米微粒造影劑直徑更小和其固有的活體內(nèi)穩(wěn)定性使得這種造影劑在血循環(huán)中具有更長的半衰期[45-46]。Lanza等用靶向納米造影劑顯像豬血管成形術(shù)后的頸動(dòng)脈，發(fā)現(xiàn)受到過度牽拉的那段血管平滑肌回聲顯著增強(qiáng)，而對(duì)血管壁內(nèi)皮信號(hào)無明顯影響，該結(jié)果有力地證實(shí)了納米級(jí)造影劑具有穿越血管內(nèi)皮間隙使血管外靶組織顯像的能力[47]。盡管這種新的無創(chuàng)傷性成像技術(shù)在腫瘤的早期定性定位診斷領(lǐng)域表現(xiàn)出良好的發(fā)展前景，但仍有很多技術(shù)需要優(yōu)化和發(fā)展，比如靶向超聲造影劑自身的組成修飾以及與 Nb的連接技術(shù)，這也是靶向超聲造影劑成功構(gòu)筑的關(guān)鍵。目前，第3代超聲造影劑的外膜多為脂質(zhì)，其厚度更薄 (約 1–3 nm)，且更易靶向修飾，能夠與Nb偶聯(lián)制備成靶向超聲造影劑，并盡可能最大程度上保持偶聯(lián)物的生物學(xué)活性。將特異性 Nb連接到超聲造影劑表面的方式主要包括共價(jià)連接和非共價(jià)連接，生物素-親和素偶聯(lián)法是應(yīng)用最廣泛的非共價(jià)連接方法，共價(jià)連接則以氨基修飾法和巰基修飾法常見。

靶向超聲造影劑能夠從分子水平特異識(shí)別并結(jié)合于病灶，在靶點(diǎn)產(chǎn)生特異性顯影，因而能更加顯著地提高對(duì)早期病變的診斷能力。以單抗修飾為基礎(chǔ)的常規(guī)微米級(jí)造影劑很難通過血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙，到達(dá)腫瘤細(xì)胞表面，因此減小微泡粒徑，開發(fā)納米級(jí)造影劑有望突破血池內(nèi)顯影的局限性。相比常規(guī)單抗，以納米抗體修飾超聲微泡構(gòu)筑的靶向造影劑，由于其分子量小，血管等組織穿透力強(qiáng)、滲透性好，靜脈注入后實(shí)際到達(dá)靶細(xì)胞的濃度高以及不易被肝臟清除等優(yōu)勢(shì)，能夠產(chǎn)生足夠高的信號(hào)強(qiáng)度，收到較為理想的顯像效果，有望研制出一種穿透力強(qiáng)的小型化靶向聲學(xué)造影劑。這將有可能克服目前超聲靶向顯像存在的缺陷，進(jìn)一步提高其靶向顯像效果，從而真正實(shí)現(xiàn)腫瘤等惡性疾病的早期靶向聲學(xué)顯像。

3 結(jié)語

近幾年，以Nb為基礎(chǔ)的分子檢測(cè)和診斷研究正處于推向市場(chǎng)的前期?；诩{米抗體的免疫傳感技術(shù)，集納米抗體與生物傳感兩者諸多優(yōu)點(diǎn)于一身，不僅可以提高檢測(cè)的靈敏度和測(cè)試精度、減少分析時(shí)間，也能使得測(cè)定過程變得簡單，易于自動(dòng)化，更能實(shí)現(xiàn)個(gè)體細(xì)胞水平的檢測(cè)和診斷。對(duì)于腫瘤等病變組織細(xì)胞的體內(nèi)靶向無創(chuàng)傷分子成像，信噪比是一個(gè)十分關(guān)鍵的指標(biāo)。因此，構(gòu)建小型化、穿透力強(qiáng)、易于工程技術(shù)制備和改造的分子便成為腫瘤靶向顯影最為關(guān)鍵的技術(shù)之一。Nb的諸多優(yōu)點(diǎn)使其在腫瘤靶向顯像診斷中具備了廣闊的臨床應(yīng)用前景。如何有效地增強(qiáng)靶部位的信號(hào)，降低正常組織的本底吸收，提高顯像質(zhì)量是以Nb為基礎(chǔ)的靶向分子顯像快速走向臨床應(yīng)用的前提。同時(shí)，也要考慮到Nb與核素或超聲造影劑的連接方式、反應(yīng)產(chǎn)率、制作成本以及連接物在生理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性等。為保持抗體的免疫學(xué)活性，常規(guī)單抗與核素或雙功能螯合劑的共軛結(jié)合可以利用抗體 Fc片段的羧化物作為特異的螯合位點(diǎn)，從而避免對(duì)抗體Fab段的活性影響。然而，由于Nb等小分子抗體一般不具有Fc片段，因此，發(fā)展一種對(duì)Nb活性損傷較小的偶聯(lián)策略尤為重要。另外，對(duì)酪氨酸的修飾有時(shí)會(huì)減少蛋白質(zhì)的活性。因此，在選擇偶聯(lián)的位點(diǎn)時(shí)，也要考慮到這一問題。在未來的十年或許更短時(shí)間內(nèi)，相信隨著對(duì)Nb更加深入的研究和臨床試驗(yàn)，基于Nb的免疫傳感與靶向分子成像技術(shù)將會(huì)實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的動(dòng)態(tài)診斷和檢測(cè)，甚至將疾病的診斷與治療及預(yù)后評(píng)價(jià)實(shí)時(shí)聯(lián)系起來，針對(duì)不同患者或同一患者的不同階段，采取合適的治療方案，益于早日實(shí)現(xiàn)個(gè)體化診療新模式。

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