王衛(wèi)遠等

[摘要] 目的 觀察脊柱關(guān)節(jié)炎（SpA）患者外周血CD14+單核細胞Toll樣受體2（TLR2）和Toll樣受體4（TLR4）的表達變化及其與臨床指標的關(guān)系，探討其在SpA的發(fā)病中的作用。 方法 選擇2008年7月～2009年1月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科確診SpA患者71例，并選擇30名健康體檢者作為正常對照組。采用流式細胞術(shù)檢測外周血CD14+單核細胞表面TLR2、TLR4陽性細胞的表達的百分率及平均熒光強度（MFI）。根據(jù)BASDAI評分將SpA患者組分為活動組54例（BASDAI評分>4分）和非活動組17例（BASDAI評分≤4分），分別比較活動組、非活動組和正常對照組三組間TLR2、TLR4陽性細胞表達百分率和MFI的差異，并分析TLR2、TLR4陽性細胞表達百分率和MFI與相關(guān)臨床和實驗室指標的相關(guān)性。 結(jié)果 TLR2+外周血CD14+單核細胞的表面表達百分率在活動組、非活動組及正常對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P > 0.05）。TLR2+外周血CD14+單核細胞表面MFI在各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P > 0.05）。TLR4+外周血CD14+單核細胞的表面表達的百分率在活動組和非活動組[（42.5±11.1）%、（32.9±9.4）%]與正常組相比[（22.3±7.5）%]，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），活動組和非活動組之間相比差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。TLR4+外周血CD14+單核細胞的MFI在各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P > 0.05）。TLR4+外周血CD14+單核細胞的表面表達的百分率與ESR和IgA呈正相關(guān)（P < 0.05），TLR2+外周血CD14+單核細胞的表面表達的百分率與ESR和IgG呈正相關(guān)（P < 0.05）。 結(jié)論 TLR4在SpA患者外周血CD14+單核細胞表面表達有顯著性變化，提示TLR4可能與SpA發(fā)生及病情存在一定的關(guān)聯(lián)，TLR4和TLR2的表達可作為疾病活動度的參考指標。

[關(guān)鍵詞] Toll樣受體；脊柱關(guān)節(jié)炎；單核細胞；流式細胞術(shù)

[中圖分類號] R593.23 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）09（a）-0062-05

[Abstract] Objective To investigate the effect and possible mechanism of Toll-like receptor-2 （TLR2） and Toll-like receptor-4 （TLR4） in the development and progress of spondyloarthropathy. Methods 71 SpA patients in the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College from July 2008 to January 2009 were selected， and 26 cases of healthy controls were selected. SpA patients of 54 cases and 17 cases were divided into the active stage group and stable stage group， according to BASDAI score. Flow cytometry analysis was used to detect the expression of CD14+ monocyte surface TLR2/4 positive cells， the TLR2 and TLR4 expression rate， the mean fluorenscence intensity （MFI） and the related clinical and laboratory indicators. Results There was no significant differences in the expression rate and MFI of TLR2 on CD14+ monocyte in the peripheral blood of SpA patients among the active stage group， stable stage group and healthy control group （P > 0.05）. The expression rates of TLR4 in the CD14+ monocytes were [（42.5±11.1）%] and [（32.9±9.4） %] respectively in the active stage group and stable stage group， both were higher than that of control group[（22.3±7.5） %]， there were significant differences among the three groups （P < 0.01）， there was also significant difference between the active stage group and stable stage group （P < 0.01）. There was no significant differences in MFI of TLR4 on CD14+ monocyte in the peripheral blood of SpA patients among the active stage group， stable stage group and healthy control group （P > 0.05）. The expressiong rate of TLR4+ correlated positively with ESR and IgA （P < 0.05）， the expressiong rate of TLR2+ correlated positively with ESR and IgG （P < 0.05）. Conclusion The expression pattern of TLR4 on CD14+ peripheral blood monocyte cells surface in SpA patients has significant changes. The results indicate that TLR4 play an important role in immune reaction of SpA. The expression of TLR2 and TLR4 in peripheral blood monocytes may help in assessing disease activity in SpA patients.endprint

[Key words] Toll like receptor； Spondyloarthropathy； Mononcyter； Flow cytometry

脊柱關(guān)節(jié)炎（spondyloarthropathy，SpA）是一組具有共同特征的相互關(guān)聯(lián)的侵犯脊柱、外周關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)周圍組織的多系統(tǒng)炎性疾病的總稱，嚴重者可發(fā)生脊柱畸形和關(guān)節(jié)強直，其病因至今尚不明確。有研究表明，感染可能是其發(fā)病因素之一。目前普遍認為，微生物可能通過感染宿主使其產(chǎn)生免疫應(yīng)答促使SpA發(fā)病。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）作為一種模式識別受體，在抗感染與免疫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用，TLRs激活后引發(fā)細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最終導(dǎo)致炎性介質(zhì)的釋放，啟動炎癥和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。目前的研究認為，TLRs在多種免疫介導(dǎo)性疾病中發(fā)揮了重要作用，SpA也是一種免疫性疾病，但目前有關(guān)TLRs與SpA的研究甚少[1]。本研究采用流式細胞術(shù)測定了SpA患者CD14+單核細胞表面TLR2和TLR4表達的百分率及平均熒光強度（mean fluorescence intension，MFI），并與正常對照進行比較。同時，分析SpA患者CD14+單核細胞表面TLR2和TLR4表達的百分率與有關(guān)臨床和實驗室指標的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2008年7月～2009年1月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科確診的SpA患者71例，SpA患者診斷均符合1991年ESSC制訂的SpA分類標準[2]，其中，強直性脊柱炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、幼年脊柱關(guān)節(jié)炎、未分化脊柱關(guān)節(jié)炎又符合各自診斷標準，均有CT證實的骶髂關(guān)節(jié)炎。排除嚴重肝炎、腫瘤和其他自身免疫病患者，且3個月內(nèi)未使用激素、免疫抑制劑和生物制劑。所有患者中男61例，女10例；年齡12～54歲，平均（27±10）歲；其中，強直性脊柱炎49例，反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎4例，幼年脊柱關(guān)節(jié)炎8例，銀屑病關(guān)節(jié)炎2例，未分化脊柱關(guān)節(jié)炎8例。所有SpA患者參照BASDAI評分評定病情活動，分為活動組54例（BASDAI評分>4分）和非活動組17例（BASDAI評分≤4分）。選擇蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院健康志愿者30名作為正常對照，其中，男26例，女4例，年齡18～41歲，平均（26±6）歲，均無SpA既往史和家族史，排除其他自身免疫性疾病和感染性疾病表現(xiàn)。各組間性別和年齡等一般情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 試劑與儀器

熒光素FITC小鼠抗人CD14單抗（克隆號H1221購自天津協(xié)和干細胞基因工程有限公司），TLR2-PE（克隆號TL2.1，購自Ebioscience公司），TLR2-PE（克隆號TTA123，購自Ebioscience公司），流式細胞儀（美國B-D公司FACS Calibur），氯化氨溶血劑和PBS洗液為蚌埠醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)實驗室自行配制。

1.3 方法

1.3.1 流式細胞染色 抽取患者和正常人肘靜脈血2 mL于抗凝管中，每份標本分裝5管，從第2管開始，依次加入CD14-FITC 4 μL、TLR2-PE 4 μL 或TLR4-PE 4 μL于管底，用鼠IgG2a抗體作為同型對照；然后加30 μL的抗凝全血混勻，置室溫避光孵育20 min，加入3 mL/管氯化氨溶血劑，充分混勻后室溫避光15 min，以破壞紅細胞。將試管置于離心機，以1500 r/min離心5 min，吸去上清液；2 mL/管PBS液（pH 7.2）洗滌2次，1500 r/min離心5 min，吸去上清液。加入PBS液（pH 7.2）300 μL，流式細胞術(shù)檢測。同樣處理的細胞設(shè)置未加熒光抗體對照管，用小鼠Ig2a-PE作表面染色的同型對照管，僅做表面染色抗人CD14-FITC單色熒光抗體染色作為調(diào)試流式細胞儀熒光補償管。

1.3.2 流式細胞術(shù)檢測細胞表面受體數(shù)據(jù)獲取及分析 在流式細胞儀上用Cellquest軟件檢測待測樣品，利用未染色管和單熒光抗體染色管設(shè)置光電倍增管（PMT）電壓和熒光補償，利用同型對照管區(qū)分是否有非特異性染色，利用未染色管和同型對照管設(shè)置陰陽界限，然后對待測樣品進行檢測。每管測定獲取105個細胞的數(shù)據(jù)。在利用Cellquest軟件分析結(jié)果時，首先在前向散射光（forward light scatter，F(xiàn)SC）和側(cè)向散射光（side light scatter，SSC）點陣圖上劃定單核細胞區(qū)域R1（region 1），然后在FL-1（CD14+-FITC）和FL-2（TLR2-PE或TLR4-PE）點陣圖上設(shè)定CD14陽性細胞群為R2，通過設(shè)門G2 =R1*R2選擇雙陽性單核細胞。選擇FL-2為X軸，G2為門的直方圖，分析TLR2和TLR4的表達百分率及MFI。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組CD14+單核細胞表面TLR2/4的表達水平比較

2.1.1 TLR2、TLR4在SpA外周血CD14+單核細胞表面陽性率比較 TLR2在SpA活動組、非活動組外周血CD14+單核細胞表面陽性率與正常組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），活動組與非活動組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。TLR4在SpA活動組、非活動組外周血CD14+單核細胞表面陽性率與正常組相比，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），活動組與非活動組相比差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見表1。endprint

3 討論

SpA最典型的疾病是強直性脊柱炎，還包括反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、炎性腸病關(guān)節(jié)炎、幼年脊柱關(guān)節(jié)炎及未分化脊柱關(guān)節(jié)炎，起病隱匿，致殘率高。目前研究認為，SpA是一種與HLA-B27不同程度相關(guān)、細菌感染誘發(fā)及機體免疫異常等多因素參與的自身免疫性疾病[3]。盡管SpA發(fā)病中觸發(fā)感染的證據(jù)甚少，但天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答在脊柱關(guān)節(jié)炎的形成中均起作用[4]。TLRs是近年來發(fā)現(xiàn)的機體感知微生物病原體病激活細胞直接產(chǎn)生免疫的天然免疫受體，TLR可以防止細菌感染宿主，但當(dāng)不適當(dāng)?shù)姆置?，它能?dǎo)致慢性炎癥和自身免疫性疾病。它的發(fā)現(xiàn)使人們重新審視了天然免疫在SpA發(fā)生機制中的作用。

TLRs是進化高度保守的Ⅰ型跨膜蛋白，目前在人類已有13種TLR（TLR1～TLR13）被鑒定出[5]TLR1、2、3、4、5和6表達在細胞表面膜，7、8和9存在于細胞內(nèi)的膜內(nèi)。TLR2、TLR4是研究最廣的受體，前者主要表達在單核細胞及樹突細胞上，識別G+菌的肽聚糖；后者表達于單核細胞、巨噬細胞、上皮細胞和內(nèi)皮細胞，識別G-菌細胞壁的主要成分脂多糖，在天然免疫中，CD14與TLR2/TLR4作為免疫受體，它通過相互間協(xié)同作用不但可以識別病原體所特有的病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），而且還可特異性識別特定內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式（danger associated molecular patterns，DAMPs）。主要通過MyD88依賴和MyD88非依賴兩條途徑[6-7]：MyD88依賴途徑是目前研究較為清楚的，TLR2/4通過該途徑尚需MAL協(xié)助MyD88募集下游IL-1受體相關(guān)激酶家族（IL-1 receptor-associated kinase family，IRAK）兩個成員：IRAK-4和IRAK-1，相繼磷酸化，活化后的IRAK-1與MyD88解離，進入胞漿募集可溶性TRAF6（TNFR-associated factor 6），TRAF6在泛素偶聯(lián)激酶（ubiqiuitin-conjugating enzyme）作用下形成復(fù)合物，該復(fù)合物可以激活TAK1激酶，活化的TAK1激酶通過激活I(lǐng)KK復(fù)合物活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和（或）AP-1，引發(fā)促炎細胞因子基因的轉(zhuǎn)錄和表達，釋放細胞因子如IL-1、IL-6和TNF-α等。簡言之，相互識別后通過耦聯(lián)信號傳導(dǎo)途徑，激活天然免疫細胞，最終引起一系列的炎性反應(yīng)，而且其為激活獲得性免疫提供共刺激信號。因此，TLR是連接天然免疫與獲得性免疫的危險信號受體，可以通過TLR引發(fā)免疫應(yīng)答，參與某些免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展[8-9]。

Wright等[10]運用蛋白組學(xué)方法比較強直性脊柱炎（AS）患者和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）患者與正常人外周血單核細胞蛋白的表達組成差異，結(jié)果顯示在AS和RA患者中遷移的單核細胞、TLRs信號傳導(dǎo)等與正常人顯著不同。最近，Assassi等[11]展示了使用全血基因表達分析表明，TLR4和5的表達顯著增加，但不是在健康對照組或系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者。印證了單核細胞的TLRs信號通路在SpA的發(fā)病中扮有重要角色。De Rycke等[12]和Yang等[13]已證明TLR2和TLR4在SpA患者血清中、外周血單個核細胞或滑膜組織顯著升高，而且其疾病的活動性與TLR4的上調(diào)有關(guān)，當(dāng)這些患者應(yīng)用抗TNF-α阻滯劑治療，TLR2、TLR4顯著降低，這一現(xiàn)象表明免疫細胞內(nèi)存在多層次不同靶點的負向調(diào)控，可以對TLR4所介導(dǎo)的信號通路的開啟和傳導(dǎo)起到精確的負調(diào)控作用，從而抑制TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]。雖然入選的患者無一例應(yīng)用生物制劑治療，但TLR4的上調(diào)仍提示它可能參與SPA的病理過程。

本研究采用流式細胞術(shù)檢測71例脊柱關(guān)節(jié)炎患者外周血CD14+單核細胞上TLR2和TLR4的表達，結(jié)果顯示，脊柱關(guān)節(jié)炎患者外周血和TLR4在CD14+單核細胞陽性率高于健康對照組，且活動期TLR4表達強于靜止期患者。這種高表達可能與其接受感染因子刺激有關(guān)，進一步證明感染作為誘因參與SpA的發(fā)病，TLR4的高表達也初步提示TLR4及其介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答與SpA發(fā)生發(fā)展存在一定相關(guān)性。而非活動期患者TLR4的表達雖然低于活動期，但也明顯高于健康對照組，推測其不僅參與了SpA的起病階段，而且在脊柱關(guān)節(jié)炎后期病情進展中也有重要作用。提示TLR4信號通路參與SpA的發(fā)病，活化的單核細胞遷移至病變的關(guān)節(jié)內(nèi)，轉(zhuǎn)化成巨噬細胞，通過TLR識別關(guān)節(jié)內(nèi)的PAMP，活化JNK、p38和NF-κB信號傳導(dǎo)通路，啟動機體的炎性反應(yīng)，并活化獲得性免疫系統(tǒng)，合成和釋放許多炎癥因子，后者除了聚集在關(guān)節(jié)滑膜上外，還會激活體內(nèi)配體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織和骨組織的破壞[15]。導(dǎo)致SpA炎性反應(yīng)慢性持續(xù)發(fā)展。

本研究顯示，TLR2的表達在SpA患者組和正常對照組相比無顯著性差異。然而，Candia等[16]觀察TLR2和TLR4受體在PsA患者單核細胞來源的抗原提呈細胞的表達發(fā)現(xiàn)，來自于PsA患者未成熟樹突狀細胞TLR2表達升高，而成熟樹突狀細胞和單核細胞與正常對照和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者相比無顯著性差異。TLR4在任何類型細胞中的表達無明顯差異，上清液中細胞因子測定顯示為Th1型，多數(shù)表達IL-2、TNF-α及IFN-γ，Western blot分析同樣證實TLR2表達增加，上調(diào)的TLR2為天然免疫在PsA中發(fā)病機制提供了支持依據(jù)。Florence等[17]研究TLR2和TLR4基因多態(tài)性在沙門腸道桿菌引發(fā)的ReA中發(fā)現(xiàn)，與正常人比較TLR4的變異體無顯著性差異，而TLR2（753Q）變異個體易進展為關(guān)節(jié)炎并具有關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，而TLR2的另外一變異體（631H）男性感染的關(guān)節(jié)外表現(xiàn)相關(guān)。最近報道由Myles等[18]發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS刺激后在肌腱端炎相關(guān)的幼年慢性關(guān)節(jié)炎中發(fā)現(xiàn)TLR2和TLR4在外周血和滑夜中單核細胞表達水平增高，并且與健康對照組相比產(chǎn)生較多的IL-6和MMP-3。上述文獻支持單核細胞通過TLR2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑參與SpA的發(fā)病，與本實驗結(jié)果不符，分析原因可能與本次入組的銀屑病關(guān)節(jié)炎及反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、幼年脊柱關(guān)節(jié)炎患者偏少相關(guān)，增加樣本量及更進一步的分組分層比較也許可以得到相同的結(jié)果。人們通過小鼠關(guān)節(jié)炎模型發(fā)現(xiàn)，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎起始階段通過TLR2活化促進血管的發(fā)生[19]，便于炎癥細胞的黏附和侵襲，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的破壞，在后期TLR4增加金屬蛋白酶介導(dǎo)的破壞作用和破骨細胞形成[20]，導(dǎo)致慢性破壞性關(guān)節(jié)炎[21]。TLR2與TLR4在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情進展過程中的相互轉(zhuǎn)換可能是其中原因之一，是否能夠在脊柱關(guān)節(jié)炎中得到合理解釋尚需更多試驗佐證。endprint

ESR和血漿CRP是反映各種炎癥活動的急性時相反應(yīng)物，臨床研究者把ESR和CRP作為判斷治療后SpA患者病情是否穩(wěn)定的實驗室指標之一。TLR4+和TLR2+細胞的比例均與ESR呈正相關(guān)，這提示TLR4和TLR2表達與SpA病情活動具有相關(guān)性。同時，TLR2+細胞比例與血清IgG定量呈正相關(guān)，TLR4+細胞的表達與血清IgA定量呈正相關(guān)，表明SpA患者存在體液免疫亢進和急性炎癥或組織損傷。因此，TLR2和TLR4表達水平可能作為評論SpA患者病情的生物學(xué)標志，阻斷這種結(jié)合可能減輕患者的臨床癥狀，但還有很多潛在的機制未能了解和發(fā)現(xiàn)，尚需要更深入的研究和發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，臨床上觀察單核細胞表面TLR2和TLR4的變化可以從一個新的角度客觀地反映機體的免疫狀態(tài)，機體激活TLR4受體的表達，產(chǎn)生天然免疫和炎性反應(yīng)，啟動特異性免疫應(yīng)答，參與SpA的發(fā)病。

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（收稿日期：2014-05-23 本文編輯：程 銘）endprint

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[15] Fitzgerald KA，Palsson-McDermott EM，Bowie AG，et al. Mal（MyD88-adapter-like）is required for Toll-like receptor-4 signal transduction [J]. Nature，2001，413（6851）：78-83.

[16] Candia L，Marquez J，Hernandez C，et al. Toll-like receptor-2 expression is upregulated in antigen-presenting cells from patients with psoriatic arthritis：a pathogenic role for innate immunity [J]. J Rheumatol，2007，34（2）：374-379.

[17] Florence WL，Tsui，Nancy X，et al. Toll-like receptor 2 variants are associated with acute reactive arthritis [J]. Arthritis Rheum，2008，58（11）：3436-3438.

[18] Myles A，Aggarwal A. Expression of Toll-like receptors 2 and 4 is increased in peripheral blood and synovial fluid monocytes of patients with enthesitis-related arthritis subtype of juvenile idiopathic arthritis [J]. Rheumatology：Oxford，2011，50（3）：481-488.

[19] Huang Q，Ma Y，Adebayo A. Increased macrophage activation mediated through toll-like receptors in rheumatoid arthritis [J]. Arthritis Rheum，2007，56（7）：2192-2201.

[20] Saber T，Veale DJ，Balogh E，et al. Toll-like receptor 2 induced angiogenesis and invasionis mediated through the Tie2 signalling pathway in rheumatoid arthritis [J]. PLoS One，2011，6（8）：e23540.

[21] Abdollahi-Roodsaz S，Joosten LA，Helsen MM，et al. Shift from toll-likereceptor2（TLR-2）toward TLR-4 Dependency in the erosive stage of chronic strep to coccal cell wall arthritis coincident with TLR-4-mediated interleukin-17 production [J]. Arthritis Rheum，2008，58（12）：3753-3764.

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[21] Abdollahi-Roodsaz S，Joosten LA，Helsen MM，et al. Shift from toll-likereceptor2（TLR-2）toward TLR-4 Dependency in the erosive stage of chronic strep to coccal cell wall arthritis coincident with TLR-4-mediated interleukin-17 production [J]. Arthritis Rheum，2008，58（12）：3753-3764.

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