朱鋒釗　杜秀園　高俊波　李秀富

摘要：通過菌株分離培養(yǎng)、生化鑒定分析了貴州省銅仁地區(qū)各屠宰場收集的150份豬扁桃體樣本，并用PCR方法對豬鏈球菌2型的主要致病毒力因子進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，150例樣本中豬鏈球菌2型帶菌率達(dá)到41.3%，其中屠宰場3的檢出率較高，mrp、epf片段與陽性對照相關(guān)基因的同源性達(dá)到100%，屠宰場3的所有樣本mrp、epf毒力因子均表現(xiàn)為陽性。說明該地區(qū)豬群豬鏈球菌2型攜帶率較高， mrp、epf毒性因子陽性表現(xiàn)型與疫病的流行可能存在一定的關(guān)聯(lián)性。

關(guān)鍵詞：豬鏈球菌；多重PCR；分子流行病學(xué)；貴州銅仁

中圖分類號：S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）08-0011-02

豬鏈球菌是一種重要的人畜共患病原菌，通常存在于豬的上呼吸道。其中以豬鏈球菌2型致病性最強(qiáng)，可以導(dǎo)致斷奶豬仔發(fā)生腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥等疾病，并可能造成人類感染致死[1，2]。隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展，豬鏈球菌的發(fā)病率不斷升高，對該產(chǎn)業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失，相關(guān)從業(yè)人員的健康安全也受到極大威脅。本研究對貴州省銅仁地區(qū)的豬群豬鏈球菌2型進(jìn)行了分子流行病學(xué)分析，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料采集和菌株培養(yǎng)

從貴州省銅仁地區(qū)各屠宰場收集來源明確的豬扁桃體共計150份。將各個扁桃體樣品培養(yǎng)分離得到單個菌落，接種于馬丁肉湯中（葡萄糖含量0.2%、小牛血清1%），于37.5 ℃下培養(yǎng)20 h。

1.2 菌株鑒定

對可疑菌落革蘭染色后進(jìn)行鏡檢，對于確定為革蘭氏陽性鏈球菌的菌落進(jìn)行過氧化氫酶實驗，結(jié)果為陰性者初步確定為豬鏈球菌2型，進(jìn)行進(jìn)一步的生化鑒定：將確定菌落分別接種于5%蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、D-核糖等培養(yǎng)基中，24 h后觀察記錄并分檢出為豬鏈球菌2型的菌株，用于后續(xù)試驗。

1.3 DNA提取

取細(xì)菌培養(yǎng)物1.5 mL，10 000r/min離心1 min，將沉淀物通過567μLTE緩沖液進(jìn)行重懸，加入10%SDS30 μL、20mg/mL蛋白酶K3 μL，在37 ℃下水浴60 min；然后加入5mol/L NaCl溶液100μL、CTAB/NaCl溶液80μL，在65℃下水浴10 min。使用24：1的氯仿-異戊醇溶液進(jìn)行抽提，然后用25：24：1的酚-氯仿-異戊醇溶液再次抽提，最后使用等體積異丙醇對核酸進(jìn)行沉淀。沉淀物用70%的乙醇清洗兩次，后溶于20μL雙蒸水中備用。

1.4 分型PCR擴(kuò)增和毒力因子檢測

對菌株DNA的cps2J、mrp、epf基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在95 ℃下進(jìn)行5 min預(yù)變性，后在95 ℃下變性40 s（退火時間和退火溫度等見表1）。其后在72 ℃下延伸30 s，循環(huán)30次后同溫度下再延伸10 min。取8μL的擴(kuò)增產(chǎn)物，在130 V電壓下于1.5%瓊脂凝膠中進(jìn)行電泳。后取條帶清晰的擴(kuò)增

摘要：通過菌株分離培養(yǎng)、生化鑒定分析了貴州省銅仁地區(qū)各屠宰場收集的150份豬扁桃體樣本，并用PCR方法對豬鏈球菌2型的主要致病毒力因子進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，150例樣本中豬鏈球菌2型帶菌率達(dá)到41.3%，其中屠宰場3的檢出率較高，mrp、epf片段與陽性對照相關(guān)基因的同源性達(dá)到100%，屠宰場3的所有樣本mrp、epf毒力因子均表現(xiàn)為陽性。說明該地區(qū)豬群豬鏈球菌2型攜帶率較高， mrp、epf毒性因子陽性表現(xiàn)型與疫病的流行可能存在一定的關(guān)聯(lián)性。

關(guān)鍵詞：豬鏈球菌；多重PCR；分子流行病學(xué)；貴州銅仁

中圖分類號：S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）08-0011-02

豬鏈球菌是一種重要的人畜共患病原菌，通常存在于豬的上呼吸道。其中以豬鏈球菌2型致病性最強(qiáng)，可以導(dǎo)致斷奶豬仔發(fā)生腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥等疾病，并可能造成人類感染致死[1，2]。隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展，豬鏈球菌的發(fā)病率不斷升高，對該產(chǎn)業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失，相關(guān)從業(yè)人員的健康安全也受到極大威脅。本研究對貴州省銅仁地區(qū)的豬群豬鏈球菌2型進(jìn)行了分子流行病學(xué)分析，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料采集和菌株培養(yǎng)

從貴州省銅仁地區(qū)各屠宰場收集來源明確的豬扁桃體共計150份。將各個扁桃體樣品培養(yǎng)分離得到單個菌落，接種于馬丁肉湯中（葡萄糖含量0.2%、小牛血清1%），于37.5 ℃下培養(yǎng)20 h。

1.2 菌株鑒定

對可疑菌落革蘭染色后進(jìn)行鏡檢，對于確定為革蘭氏陽性鏈球菌的菌落進(jìn)行過氧化氫酶實驗，結(jié)果為陰性者初步確定為豬鏈球菌2型，進(jìn)行進(jìn)一步的生化鑒定：將確定菌落分別接種于5%蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、D-核糖等培養(yǎng)基中，24 h后觀察記錄并分檢出為豬鏈球菌2型的菌株，用于后續(xù)試驗。

1.3 DNA提取

取細(xì)菌培養(yǎng)物1.5 mL，10 000r/min離心1 min，將沉淀物通過567μLTE緩沖液進(jìn)行重懸，加入10%SDS30 μL、20mg/mL蛋白酶K3 μL，在37 ℃下水浴60 min；然后加入5mol/L NaCl溶液100μL、CTAB/NaCl溶液80μL，在65℃下水浴10 min。使用24：1的氯仿-異戊醇溶液進(jìn)行抽提，然后用25：24：1的酚-氯仿-異戊醇溶液再次抽提，最后使用等體積異丙醇對核酸進(jìn)行沉淀。沉淀物用70%的乙醇清洗兩次，后溶于20μL雙蒸水中備用。

1.4 分型PCR擴(kuò)增和毒力因子檢測

對菌株DNA的cps2J、mrp、epf基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在95 ℃下進(jìn)行5 min預(yù)變性，后在95 ℃下變性40 s（退火時間和退火溫度等見表1）。其后在72 ℃下延伸30 s，循環(huán)30次后同溫度下再延伸10 min。取8μL的擴(kuò)增產(chǎn)物，在130 V電壓下于1.5%瓊脂凝膠中進(jìn)行電泳。后取條帶清晰的擴(kuò)增

摘要：通過菌株分離培養(yǎng)、生化鑒定分析了貴州省銅仁地區(qū)各屠宰場收集的150份豬扁桃體樣本，并用PCR方法對豬鏈球菌2型的主要致病毒力因子進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，150例樣本中豬鏈球菌2型帶菌率達(dá)到41.3%，其中屠宰場3的檢出率較高，mrp、epf片段與陽性對照相關(guān)基因的同源性達(dá)到100%，屠宰場3的所有樣本mrp、epf毒力因子均表現(xiàn)為陽性。說明該地區(qū)豬群豬鏈球菌2型攜帶率較高， mrp、epf毒性因子陽性表現(xiàn)型與疫病的流行可能存在一定的關(guān)聯(lián)性。

關(guān)鍵詞：豬鏈球菌；多重PCR；分子流行病學(xué)；貴州銅仁

中圖分類號：S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）08-0011-02

豬鏈球菌是一種重要的人畜共患病原菌，通常存在于豬的上呼吸道。其中以豬鏈球菌2型致病性最強(qiáng)，可以導(dǎo)致斷奶豬仔發(fā)生腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥等疾病，并可能造成人類感染致死[1，2]。隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展，豬鏈球菌的發(fā)病率不斷升高，對該產(chǎn)業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失，相關(guān)從業(yè)人員的健康安全也受到極大威脅。本研究對貴州省銅仁地區(qū)的豬群豬鏈球菌2型進(jìn)行了分子流行病學(xué)分析，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料采集和菌株培養(yǎng)

從貴州省銅仁地區(qū)各屠宰場收集來源明確的豬扁桃體共計150份。將各個扁桃體樣品培養(yǎng)分離得到單個菌落，接種于馬丁肉湯中（葡萄糖含量0.2%、小牛血清1%），于37.5 ℃下培養(yǎng)20 h。

1.2 菌株鑒定

對可疑菌落革蘭染色后進(jìn)行鏡檢，對于確定為革蘭氏陽性鏈球菌的菌落進(jìn)行過氧化氫酶實驗，結(jié)果為陰性者初步確定為豬鏈球菌2型，進(jìn)行進(jìn)一步的生化鑒定：將確定菌落分別接種于5%蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、D-核糖等培養(yǎng)基中，24 h后觀察記錄并分檢出為豬鏈球菌2型的菌株，用于后續(xù)試驗。

1.3 DNA提取

取細(xì)菌培養(yǎng)物1.5 mL，10 000r/min離心1 min，將沉淀物通過567μLTE緩沖液進(jìn)行重懸，加入10%SDS30 μL、20mg/mL蛋白酶K3 μL，在37 ℃下水浴60 min；然后加入5mol/L NaCl溶液100μL、CTAB/NaCl溶液80μL，在65℃下水浴10 min。使用24：1的氯仿-異戊醇溶液進(jìn)行抽提，然后用25：24：1的酚-氯仿-異戊醇溶液再次抽提，最后使用等體積異丙醇對核酸進(jìn)行沉淀。沉淀物用70%的乙醇清洗兩次，后溶于20μL雙蒸水中備用。

1.4 分型PCR擴(kuò)增和毒力因子檢測

對菌株DNA的cps2J、mrp、epf基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在95 ℃下進(jìn)行5 min預(yù)變性，后在95 ℃下變性40 s（退火時間和退火溫度等見表1）。其后在72 ℃下延伸30 s，循環(huán)30次后同溫度下再延伸10 min。取8μL的擴(kuò)增產(chǎn)物，在130 V電壓下于1.5%瓊脂凝膠中進(jìn)行電泳。后取條帶清晰的擴(kuò)增