徐 幫，鄒 坤，郭玲芝，劉呈雄，程 凡

三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，宜昌 443002

昆蟲是生物界種類數(shù)量最多的類群，約占全球生物多樣性的一半。昆蟲與微生物的共生是一種普遍的現(xiàn)象，其種類之多、數(shù)量之大及分布之廣則意味著昆蟲共生菌有豐富的多樣性，源自其中的共生真菌可能會(huì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎，類型豐富的活性次級代謝產(chǎn)物，因而昆蟲共生真菌已成為尋找新生物活性物質(zhì)的新的重要來源［1］。但目前，人們對昆蟲共生菌研究的很少，對其代謝產(chǎn)物研究更少。

本文作者從中華劍角蝗的腸道中分離得到一株草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株，對其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了化學(xué)研究，從中分離得到6個(gè)化合物，通過波譜數(shù)據(jù)分析及理化性質(zhì)鑒定了它們的結(jié)構(gòu)，確定為苯并吡喃酮二聚體類化合物，所有化合物均為首次從該屬菌種中分離得到。采用MTT法進(jìn)行了細(xì)胞毒活性的測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物1對人體肝癌細(xì)胞Hep G2具有顯著的細(xì)胞毒活性，其IC50值為1.1 μM。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker AV 400核磁共振波譜儀，瑞士布魯克公司;AmozonSL+1200液相色譜-雙重漏斗傳輸離子阱質(zhì)譜儀，德國布魯克·道爾頓公司;Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀，美國戴安公司;Cosmosil MS-II RP-C18色譜柱(5 μm，250 ×10 mm 半制備型;5 μm，250×4.6 mm 分析型);低溫冷凍干燥機(jī)，美國Labconco公司;WZZ-2S數(shù)字式自動(dòng)旋光儀，上海精科;薄層色譜硅膠GF254，青島海洋化工有限公司;正相色譜硅膠，煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所;反相色譜硅膠，日本 YMC公司;Sephadex LH-20，美國Pharmacia公司;除了分析和制備用的色譜純乙腈外，其它試劑均為分析純。

1.2 菌株和細(xì)胞株

實(shí)驗(yàn)菌株分離自中華劍角蝗腸道，昆蟲樣品于2011年7月采集于湖北省神農(nóng)架大九湖國家濕地公園，菌株由三峽大學(xué)涂璇博士鑒定為草酸青霉(Penicillium oxalicum)，保存于三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;人肝癌細(xì)胞Hep G2購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，由三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室傳代保藏。

1.3 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基:SDA培養(yǎng)基(葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH值自然);SD培養(yǎng)基(葡萄糖40 g，蛋白胨 10 g，水 1000 mL，pH 值自然)，1.25×105Pa滅菌20 min。

1.4 菌株P(guān)enicillium oxalicum的發(fā)酵

菌株經(jīng)SDA培養(yǎng)基斜面活化后，接種于SD種子培養(yǎng)基中，于28℃、125 rpm振蕩培養(yǎng)3 d;將培養(yǎng)好的種子以5%的接種量接種于SD發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃、125 rpm振蕩培養(yǎng)16 d，共發(fā)酵40 L。

1.5 細(xì)胞毒活性的測試——MTT法［2］

培養(yǎng)細(xì)胞按1×105個(gè)/mL的密度種植于96孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，將待測藥物配制成6個(gè)濃度梯度，加入到96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)濃度梯度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白孔(含細(xì)胞的培養(yǎng)液+MTT+DMSO)、陽性藥物孔(含細(xì)胞的培養(yǎng)液+25 μg/mL絲裂霉素+MTT+DMSO)及調(diào)零孔(培養(yǎng)液+MTT+DMSO)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，于每孔中加入20 μL的 MTT試劑(5 mg/mL)顯色，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出孔內(nèi)的培養(yǎng)液，于每孔中加入150 μL的DMSO，震蕩搖勻10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀490 nm波長下測其OD值，按公式計(jì)算抑制率。計(jì)算公式:生長抑制率(%)=(1-藥物孔OD/空白孔OD)×100%。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)值。

2 提取與分離

發(fā)酵液40 L過濾，用乙酸乙脂萃取濾液，減壓濃縮得12.2 g粗提物;菌絲體經(jīng)37℃烘干處理后，用氯仿-甲醇(1∶1)浸提烘干的菌絲體，過濾，上清液減壓濃縮得10.6 g粗提物。將上述粗提物合并，經(jīng)正相硅膠柱色譜(800 g正相硅膠，200～300目)分離，氯仿-甲醇(100∶0 ～50∶50%，v/v)梯度洗脫，得5個(gè)洗脫部分(Ⅰ～Ⅴ)。Ⅰ部分中的流分Fr.2析出黃色晶體化合物1(36.6 mg)。?、虿糠?.3 g，經(jīng)加壓反相硅膠柱色譜分離，以乙腈-水(30∶70～100∶0，v/v)梯度洗脫，合并流分 Fr.23-25，經(jīng)反相HPLC 制備，乙腈-水(48∶52，v/v)洗脫，得到化合物2(15.3 mg)，化合物4(5.2 mg)，化合物 5(9.4 mg)。合并流分Fr.26-29，經(jīng)反相HPLC制備，乙腈-水(68∶32，v/v)洗脫，得到化合物 3(4.2 mg)，化合物6(8.6 mg)。

圖1 化合物1～6的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of Compound 1-6

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 黃色針晶;ESI-MS m/z:639［M+1］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:13.78(2H，s，8，8'-OH)，11.74(2H，s，1，1'-OH)，7.45(2H，d，J=8.5Hz，H-3，3')，6.63(2H，d，J=8.5 Hz，H-4，4')，3.93(2H，d，J=11 Hz，H-5，5')，3.72(6H，s，13，13'-OCH3)，2.73(2H，dd，J=6.0，19.1 Hz，H-7a，7a')，2.41(2H，m，H-6，6')，2.31(2H，dd，J=10.5，19.2 Hz，H-7b，7b')，1.17(6H，d，J=6.6 Hz，H-11，11');13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:187.2(C-9，9')，177.5(C-8，8')，170.3(C-12，12')，159.4(C-1，1')，158.3(C-4a，4a')，140.2(C-3，3')，117.3(C-2，2')，107.5(C-4，4')，106.3(C-9a，9a')，101.7(C-8a，8a')，84.7(C-10a，10a')，77.0(C-5，5')，53.2(13，13'-OCH3)，36.3(C-7，7')，29.3(C-6，6')，18.0(C-11，11')。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［3-5］的波譜數(shù)據(jù)，化合物1可能是secalonic acid A(SAA)或secalonic acid D(SAD)，兩者不同之處在于 5、6、10a 和 5'、6'、10a'位羥基構(gòu)型不同。通過測定比旋光度與文獻(xiàn)值相比較，化合物1的比旋光度［α］-73.3°(c=0.10，氯仿)，文獻(xiàn)中，SAD 的比旋光度［α］+88°(c=0.10，氯仿)［3，5］，SAA 的比旋光度［α］20D-75°(c=0.10，氯仿)［4］。最終鑒定化合物 1 為 secalonic acid A。

化合物2 黃色無定形粉末;ESI-MS m/z:557［M+1］+;1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)，δ:15.34(1H，s，5'-OH)，12.76(1H，s，5-OH)，10.14(1H，s，OH-8)，7.14(1H，s，H-7)，7.01(1H，s，H-6)，6.42(1H，d，J=2.3 Hz，H-7')，6.34(1H，s，H-3)，6.24(1H，d，J=2.2 Hz，H-9')，6.02(1H，s，H-3')，4.00(3H，s，6'-OCH3)，3.65(3H，s，8'-OCH3)，3.44(3H，s，10-OCH3)，2.48(3H，s，2-CH3)，2.16(3H，s，2'-CH3);13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)，δ:184.2(C-4')，182.8(C-4)，167.7(C-2')，166.6(C-2)，165.9(C-5')，164.0(C-8')，162.5(C-6')，161.5(C-8)，157.2(C-10)，156.5(C-5)，156.2(C-10b)，152.0(C-10a')，140.9(C-6a)，140.7(C-9a')，116.0(C-9)，110.8(C-3)，109.4(C-4a)，108.0(C-5a')，107.6(C-3')，105.9(C-10a)，105.6(C-7)，104.6(C-10')，104.3(C-6)，101.6(C-4a')，97.5(C-9')，95.7(C-7')，61.3(10-OCH3)，56.2(6'-OCH3)，55.3(8'-OCH3)，20.7(2'-CH3)，20.5(2-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］報(bào)道一致，故鑒定化合物2為asperpyrones A。

化合物3 黃色無定形粉末;ESI-MS m/z:571［M+1］+;1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)，δ:13.21(1H，s，5'-OH)，12.95(1H，s，5-OH)，7.29(1H，s，H-6)，7.12(1H，s，H-7)，6.63(1H，d，J=2.2 Hz，H-9')，6.56(1H，s，H-3')，6.54(1H，s，H-3)，6.10(1H，d，J=2.2 Hz，H-7')，4.01(3H，s，10'-OCH3)，3.74(3H，s，8-OCH3)，3.59(3H，s，8'-OCH3)，3.46(3H，s，10-OCH3)，2.56(3H，s，2'-CH3)，2.48(3H，s，2-CH3);13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)，δ:182.4(C-4')，182.3(C-4)，168.2(C-2)，167.8(C-2')，161.1(C-8')，159.6(C-8)，159.3(C-10')，156.2(C-10)，156.1(C-5)，155.6(C-10b')，155.0(C-10b)，153.6(C-5')，140.2(C-6a')，139.9(C-6a)，117.4(C-9)，109.9(C-3)，109.8(C-3')，109.1(C-6')，108.4(C-4a)，107.5(C-4a')，107.3(C-10a)，105.4(C-6)，104.0(C-10a')，101.9(C-7)，96.9(C-9')，96.3(C-7')，60.9(8'-OCH3)，56.3(8-OCH3)，55.9(10'-OCH3)，55.1(10-OCH3)，19.9(CH3-2')，19.8(CH3-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］報(bào)道一致，故鑒定化合物3為asperpyrones B。

化合物4 黃色無定形粉末;ESI-MS m/z:569［M+1］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)，δ:15.24(1H，s，5-OH)，12.83(1H，s，5'-OH)，7.26(1H，s，H-10)，7.05(1H，s，H-9)，6.43(1H，d，J=2.2 Hz，H-9')，6.33(1H，s，H-3')，6.19(1H，d，J=2.2 Hz，H-7')，6.00(1H，s，H-3)，4.03(3H，s，10'-OCH3)，3.78(3H，s，8-OCH3)，3.61(3H，s，6-OCH3)，3.42(3H，s，8'-OCH3)2.48(3H，s，2'-CH3)，2.12(3H，s，2-CH3);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:184.5(C-4)，182.9(C-4')，167.4(C-2)，166.8(C-2')，162.8(C-5)，161.7(C-8')，161.6(C-10')，160.0(C-6)，156.9(C-5')，156.7(C-8)，155.1(C-10b')，150.8(C-10a)，140.8(C-6a')，140.6(C-9a)，117.1(C-7)，110.6(C-5a)，109.4(C-3')，108.6(C-4a')，108.0(C-3)，107.3(C-6')，106.0(C-9)，105.0(C-10a')，104.2(C-4a)，101.5(C-10)，97.0(C-9')，96.3(C-7')，61.2(6-OCH3)，56.1(10'-OCH3)，56.0(8-OCH3)，55.2(8'-OCH3)，20.7(2-CH3)，20.6(2'-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］報(bào)道一致，故鑒定化合物4為asperpyrone C。

化合物5 黃色無定形粉末;ESI-MS m/z:557［M+1］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:14.86(1H，s，5-OH)，13.48(1H，s，5'-OH)，7.30(1H，s，H-9)，7.19(1H，s，H-10)，7.11(1H，d，J=2.2 Hz，H-9')，6.50(1H，s，H-3')，6.19(1H，d，J=2.2 Hz，H-7')，6.00(1H，s，H-3)，4.03(3H，s，10'-OCH3)，3.78(3H，s，6-OCH3)，3.61(3H，s，8'-OCH3)，2.48(3H，s，2'-CH3)，2.12(3H，s，2-CH3);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:184.5(C-4)，182.7(C-4')，167.6(C-2)，166.9(C-2')，162.3(C-5)，161.7(C-8')，161.6(C-10')，160.0(C-6)，156.9(C-5')，156.7(C-8)，155.1(C-10b')，150.8(C-10a)，140.8(C-6a')，140.6(C-9a)，117.1(C-7)，110.6(C-5a)，109.4(C-3')，108.6(C-4a')，108.0(C-3)，107.3(C-6')，106.0(C-9)，105.0(C-10a')，104.2(C-4a)，101.5(C-10)，97.0(C-9')，96.3(C-7')，61.2(6-OCH3)，56.0(10'-OCH3)，55.1(8'-OCH3)，20.8(2-CH3)，20.5(2'-CH3)?；衔?與化合物4的NMR數(shù)據(jù)相比較，除了少一個(gè)甲氧基以外，其他數(shù)據(jù)幾乎完全相同。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］報(bào)道一致，故鑒定化合物5為asperpyrone D。

化合物6 黃色無定形粉末;ESI-MS m/z:571［M+1］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)，δ:15.25(1H，s，5'-OH)，14.83(1H，s，5-OH)，7.15(1H，s，H-10)，6.97(1H，s，H-9)，6.42(1H，d，J=2.2 Hz，H-7')，6.21(1H，d，J=2.2 Hz，H-9')，6.05(1H，s，H-3)，5.98(1H，s，H-3')，4.02(3H，s，6'-OCH3)，3.79(3H，s，8-OCH3)，3.62(3H，s，8'-OCH3)，3.46(3H，s，6-OCH3)，2.42(3H，s，2-CH3)，2.12(3H，s，2'-CH3);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:184.6(C-4')，184.4(C-4)，167.6(C-2)，167.5(C-2')，162.7(C-5')，162.0(C-5)，161.4(C-8')，161.1(C-6')，160.2(C-8)，158.6(C-6)，153.4(C-10a)，150.8(C-10a')，140.7(C-9a)，140.5(C-9a')，117.1(C-7)，111.4(C-5a)，108.6(C-5a')，107.4(C-3)，107.2(C-3')，105.2(C-10')，104.7(C-4a)，104.3(C-4a')，101.3(C-9)，101.2(C-10)，96.9(C-7')，96.5(C-9')，62.0(6-OCH3)，56.2(6'-OCH3)，55.9(8-OCH3)，55.1(8'-OCH3)，20.8(2-CH3)，20.5(2'-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］報(bào)道一致，故鑒定化合物6為aurasperone A。

4 活性分析

采用MTT法測定化合物對人體肝癌細(xì)胞Hep G2的生長抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物1具有顯著的細(xì)胞毒活性，其IC50值為1.1 μM。

5 結(jié)語

苯并吡喃酮類化合物的單體及二聚體類廣泛分布于黑曲霉和鐮刀屬真菌的次級代謝產(chǎn)物中［9-12］。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這類化合物對大鼠和小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)出急性毒性作用［13］，并且對 Taq DNA聚合酶具有抑制作用［5］。最近研究表明很多來源于真菌次級代謝產(chǎn)物的苯并吡喃酮類化合物都具有一定的抗腫瘤活性，具有十分重要的研究與開發(fā)價(jià)值，其作用機(jī)制更是有待于進(jìn)一步研究。

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