王熙濤， 徐永平， 金禮吉， 李淑英， 尤建嵩， 汪 將， 李建光， 張美霞， 宋亞雄

（1.大連理工大學動物生物技術與營養(yǎng)研究室，遼寧大連 116024；2.大連賽姆生物工程技術有限公司，遼寧大連 116620；3.動物性食品安全保障技術工程研究中心，遼寧大連 116024）

鼠尾藻、馬尾藻、海帶等海藻是刺參飼料中最常見的飼料原料，其中鼠尾藻被認為是刺參的最佳優(yōu)質餌料，但是隨著鼠尾藻資源的大量開采，現(xiàn)已面臨供不應求，價格居高不下的困境。而海帶由于其成本低廉、產量高、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點也經常用作刺參飼料原料（尚德榮等，2011）。但是由于海帶細胞壁褐藻膠含量較高限制了其作為刺參優(yōu)質餌料的使用。刺參體內褐藻酸酶活性處于很低的水平，因此對海帶等富含褐藻膠的大型藻類消化能力較弱，大多數(shù)飼料成分不能被充分消化，這不僅造成飼料的浪費，而且水體里含有大量黏性較高的褐藻膠等殘餌，如果處理不當也會導致刺參養(yǎng)殖環(huán)境的惡化（郭娜等，2011；唐黎等，2007）。

針對以上問題，本研究篩選出一株能高效降解海帶中褐藻膠且對刺參無潛在危害的有益菌，并探討了其降解海帶褐藻膠的最佳發(fā)酵條件，以期能有效降解海帶飼料中刺參難以消化的褐藻膠成分，從而顯著提高刺參對海帶的消化率、利用率；并為進一步生產刺參微生物脫膠海帶發(fā)酵飼料提供初步理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 健康刺參，購自廣鹿島某海參養(yǎng)殖場，體重5～10 g不等，沙濾海水中暫養(yǎng)2周，不投喂食物，水質因子為溶氧≥6 mg/L，溫度控制在（18±1）℃，鹽度為 28‰ ～ 30‰，pH 為 8.0±0.4，每天更換1/3總體積的水以保證水質，并吸底排污一次至刺參不再排便為止。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種篩選培養(yǎng)基及降解褐藻膠的發(fā)酵液組成 褐藻酸鈉固體選擇性培養(yǎng)基（%，m/V）：褐藻酸鈉 0.5 g， 硫酸銨 0.5 g，NaCl 3.0 g，K2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g， 瓊脂1.5 g，蒸餾水 100 mL，pH 7.5；褐藻酸鈉液體選擇性培養(yǎng)基（%，m/V）：褐藻酸鈉 0.5 g，硫酸銨 0.5 g，NaCl 3.0 g，K2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g，蒸餾水 100 mL，pH 7.5；降解褐藻膠的發(fā)酵液組成：200 mL搖瓶中含有海帶粉20 g，K2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g，另補充一定濃度褐藻酸鈉、氮源、氯化鈉；種子培養(yǎng)基各成分同褐藻酸鈉液體選擇性培養(yǎng)基。

1.2.2 菌種的分離篩選 采用以褐藻酸鈉為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基進行篩選，經菌種活化、平皿粗篩、搖瓶復篩、挑取平皿中長勢良好的單菌落、馴化及菌保等步驟，獲得能降解褐藻膠的菌株W16。

1.2.3 菌株對刺參的安全性試驗 菌種接種于2216E液體培養(yǎng)基中，置28℃、130 r/min下培養(yǎng)12 h后，離心菌液，倒去上清，用滅菌海水重懸制成菌懸液，調整濃度到5×109cfu/mL。取健康刺參40只，分為兩組，分別為菌懸液組和滅菌海水對照組。每只刺參一次腹腔注射100 μL菌液，連續(xù)注射3 d，對照組每個刺參注射100 μL無菌海水，每日觀察兩次，記錄各組刺參生存狀態(tài)，發(fā)病率。15 d后，統(tǒng)計結果。

1.2.4 菌株的鑒定

1.2.4.1 16S rDNA基因的PCR擴增 按照標準方法 （Wilson，1997）提取菌株 W16的基因組DNA。使用 Smart Taq Pre-Mix試劑盒擴增16S rDNA，PCR擴增通用引物 （Martin和 Collen，1998）：27F （5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3'）；1429R（5'GGTTACCTTGTTACGACTT3'）。

PCR 反應體系（50 μL）：DNA 2 μL，正向引物27F（10 pmol/μL）1 μL，反向引物 1492R（10 pmol/μL）1 μL，rTaq DNA 聚合酶 （包含 PCR 反應緩沖液，dNTP 混合物）25 μL，ddH2O 21 μL。

PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃復性 30 s， 共 35個循環(huán)；72℃延伸 90 s，72℃延伸 10 min；4℃保存。

1.2.4.2 16SrDNA基因測序及菌種鑒定 所得PCR結果寄送大連萬澤貿易有限公司測序。測序結果使用NCBI的Blast軟件與GenBank數(shù)據庫中的已知種類的微生物的16S rDNA基因序列進行比對，得到相似度，并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 海帶褐藻膠相對降解量的測定 海帶褐藻膠相對降解量采用紫外吸收法測定，褐藻膠降解產物褐藻寡糖在235 nm處有特征光吸收值。此處的光吸收值的大小可作為褐藻膠相對降解程度的評判（Baron 等，1994）。

1.2.6 生物量的測定 取菌懸液200 μL，于600 nm處測定吸光值，以未加菌液的發(fā)酵液作空白對照。發(fā)酵液中有海帶粉時，用濾紙過濾除去海帶粉末，再按1.2.5中的方法測吸光值。

1.2.7 海帶褐藻膠降解條件優(yōu)化 海帶褐藻膠降解能力和生物量測定方法如上所述，每組試驗重復兩次，每次試驗三組平行，每一步優(yōu)化結果都用于后續(xù)試驗。

1.2.7.1 發(fā)酵時間對菌株生長和褐藻膠降解量的影響 每隔24 h取一次樣品，研究不同發(fā)酵時間 ：24、48、72、96、120、144 h對發(fā)酵培養(yǎng)菌株W16生長和褐藻膠降解程度的影響。

1.2.7.2 發(fā)酵溫度對菌株生長和褐藻膠降解量的影響 在以上條件的基礎上，分別在15、20、25、30、35℃下對菌株W16進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，研究不同溫度對菌株生長和褐藻膠降解程度的影響。

1.2.7.3 誘導物褐藻酸鈉添加量對菌株生長和產酶的影響 以褐藻酸鈉作為產褐藻膠裂解酶的誘導物，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同含量的褐藻酸鈉（m/V）：0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%，分別對菌株W16進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定生物量和褐藻膠降解量。

1.2.7.4 補充氮源對菌株生長和褐藻膠降解程度的影響 分別以 0.3%（NH4）2SO4、0.3%牛肉膏、0.3%NH4Cl、0.3%蛋白胨、0.3%尿素（m/V）為補充氮源加入發(fā)酵液中，研究不同補充氮源對菌株生長和褐藻膠降解量的影響。

1.2.7.5 氯化鈉濃度對菌株生長和產酶的影響配制含不同濃度 NaCl（1%、1.5%、2%、2.5%、3%和3.5%）的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，分別對菌株W16進行發(fā)酵培養(yǎng)，研究不同NaCl濃度對菌株生長和褐藻膠降解量的影響。

1.2.7.6 起始pH對菌株生長和產酶的影響 分別調節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始 pH 為 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，對菌株W16進行發(fā)酵培養(yǎng)，研究不同pH對菌株生長和褐藻膠降解量的影響。

1.2.7.7 裝液量對菌株生長和產酶的影響 選擇料液比為1∶30，在200 mL三角瓶中，分別裝入20、40、60、80、100、120 mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后分別按1%體積加入種子液，研究不同裝液量對菌株生長和褐藻膠降解量的影響。

1.2.7.8 正交試驗設計 對上述單因素試驗中的7個因素進行考察，選取其中對菌株W16生長和褐藻膠降解量影響較大的4個因素設計正交試驗，綜合考察各因素對菌株生長和褐藻膠降解量的影響，每個因素選取3個水平。

2 結果與討論

2.1 菌株W16對刺參安全性試驗結果 5×109cfu/mL菌懸液連續(xù)給刺參腹腔注射3 d，經過15 d觀察后，試驗組刺參和空白對照組刺參均在養(yǎng)殖箱中貼壁生長，狀態(tài)良好，未出現(xiàn)腐皮、潰爛或搖頭等不良反應，表明高濃度W16對刺參的生長無任何致病作用。

2.2 16S rDNA分析結果 對菌株W16的16S rDNA基因序列測定結果表明，該菌的16S基因組大小為1421 Da。根據 BLAST軟件在線分析，與該序列相似度大于 95%的序列均來自Bacillus屬細菌，該序列與Bacillus flexus strain NM25序列的相似度最高，最大匹配度達到100%。因此，該菌株被鑒定為Bacillus flexus。Bacillus屬系統(tǒng)進化樹見圖1。Bacillus flexus菌種特征為：桿狀，G+，形成卵圓形內生芽孢，好氧?？赡?%～10%NaCl濃度。葡萄糖、半乳糖、蔗糖產酸；乳糖、阿拉伯糖、甘露醇、麥芽糖、棉子糖、海藻糖不產酸。接觸酶、氧化酶陽性。

圖1 根據16S rDNA基因序列構建的W16與其親源關系較近的Bacillus代表菌株的系統(tǒng)進化樹

本試驗篩選得到一株芽孢桿菌，能降解海帶中褐藻膠且對刺參無致病性，16S rDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建表明，該菌株與芽孢桿菌Bacillus flexus有較高的同源性。雖然在養(yǎng)殖過程中，很多類型的芽孢桿菌都可作為益生菌加入到飼料中使用，但是從實際生產的安全性考慮，本試驗考察了該菌株對刺參是否具有潛在致病性，結果表明在濃度達到109cfu/mL時，該菌株仍然對刺參無任何致病性，因此可作為刺參的有益菌使用。

2.3 發(fā)酵液組成和發(fā)酵條件對試驗菌株生長和降解褐藻膠能力的影響

2.3.1 發(fā)酵時間對菌株生長和降解褐藻膠能力的影響 由圖2可見，在發(fā)酵的最初48 h，菌體生長快，生物量達到最大，但是相對褐藻膠降解量保持較低水平，并緩慢上升。這可能是因為W16不是專一性降解褐藻膠的菌種，在發(fā)酵過程中，菌株W16優(yōu)先利用了發(fā)酵液中其他營養(yǎng)成分，生長旺盛后再逐步利用海帶中褐藻膠，至96 h褐藻膠降解量達到最大值；當繼續(xù)培養(yǎng)時，菌體逐漸進入衰亡期，相對褐藻膠降解量逐漸下降。因此后續(xù)試驗選取96 h作為發(fā)酵培養(yǎng)時間。

圖2 發(fā)酵時間對W16菌株生長及褐藻膠降解量的影響

2.3.2 發(fā)酵溫度對菌株生長和褐藻膠降解量的影響 由圖3可見，菌體生長對試驗溫度相對不敏感，在試驗溫度范圍內，菌種均生長良好，在25℃時生物量達到最大值。試驗菌株降解褐藻膠的能力與發(fā)酵培養(yǎng)溫度密切相關，在10℃時，菌株降解褐藻膠能力最低，隨著溫度的升高，菌株降解褐藻膠能力也隨著增大。當超過30℃時菌株降解褐藻膠能力又再度下降，因此在30℃時菌株降解褐藻膠能力最強。因此選定培養(yǎng)溫度為30℃做后續(xù)發(fā)酵試驗。

圖3 發(fā)酵溫度對菌株生長和褐藻膠降解量的影響

2.3.3 褐藻酸鈉添加量對菌株生長和褐藻膠降解量的影響 本試驗選擇褐藻酸鈉作為誘導劑，考察其添加量對菌株生長和褐藻膠降解量的影響。由圖4可見，隨著褐藻酸鈉添加量的增加，菌種生物量變化相對不顯著，但是褐藻膠降解量不斷增大，當褐藻酸鈉濃度達到0.15%時，菌株降解褐藻膠能力最強，隨著褐藻酸鈉添加量繼續(xù)增加，菌種降解褐藻膠能力未明顯增強，而是趨于穩(wěn)定。因此，選定褐藻酸鈉濃度為0.15%做后續(xù)發(fā)酵試驗。

圖4 褐藻酸鈉添加量對菌株生長和褐藻膠降解量的影響

2.3.4 補充氮源對菌株生長和褐藻膠降解量的影響

2.3.4.1 不同氮源種類對試驗菌株生長和褐藻膠降解量的影響 由圖5可見，添加不同氮源均能促進W16菌株生長，但促進程度不同。有機氮源添加組的生物量均高于無機氮源添加組，可能是因為有機氮源中營養(yǎng)物質豐富，更有利于菌株生長，但是無機氮源組的褐藻膠降解量卻高于有機氮源組，綜合考慮生物量和褐藻膠降解量，選取二者都相對較高的硫酸銨做后續(xù)試驗。

圖5 不同氮源對菌株生長和褐藻膠降解量的影響

2.3.4.2 硫酸銨濃度對菌株生長和褐藻膠降解量的影響 由圖6可見，隨著硫酸銨濃度的增加，試驗菌株的生長量和降解褐藻膠的能力表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在氮源濃度為0.3%時，測得的生物量和褐藻膠降解量均最高，故選定補充氮源硫酸銨濃度為0.3%做后續(xù)試驗。

圖6 硫酸銨濃度對菌株生長和相對褐藻膠降解量的影響

2.3.5 氯化鈉濃度對菌株生長和褐藻膠降解量的影響 由圖7可見，當氯化鈉濃度在1.5%～3.5%，對菌株生物量影響不大，符合海洋細菌的嗜鹽特點。但是，氯化鈉濃度對菌株降解褐藻膠能力的影響較大，這與文獻報道的褐藻膠裂解酶需要Na+、K+的激活相符（Ma 等，2008）。 隨著 NaCl濃度增加，菌株W16產酶能力不斷提高，當濃度大于2.5%后變化幅度趨于緩慢，故選擇2.5%NaCl濃度發(fā)酵培養(yǎng)菌株W16。

圖7 NaCl濃度對菌株生長和褐藻膠降解量的影響

2.3.6 起始pH對菌株生長和褐藻膠降解量的影響 由圖8可見，發(fā)酵培養(yǎng)液中起始pH對試驗菌株生物量和降解褐藻膠能力均有一定影響，綜合考慮，選取生物量和褐藻膠降解量均較高的pH=7的中性環(huán)境作為后續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)條件。

圖8 起始pH對菌株生長和褐藻膠降解量影響

2.3.7 裝液量對菌株生長和褐藻膠降解量的影響 由圖9可見，裝液量的大小主要影響發(fā)酵過程中的通氣及溶氧情況，溶氧水平低，即裝液量太大，不利于菌株生長和產酶。當裝液量為50 mL時，生物量和褐藻膠降解量均達到最大值，因此選取40 mL裝液量最為適宜。

圖9 裝液量對菌株生長和褐藻膠降解量的影響

2.3.8 正交試驗優(yōu)化發(fā)酵條件 采用正交試驗對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。綜合考慮選取對褐藻膠降解能力有較大影響的4個因素，即：發(fā)酵時間、發(fā)酵起始pH、發(fā)酵溫度和褐藻酸鈉濃度，按照四因素三水平L9（34）安排正交試驗。發(fā)酵時間為A1=72 h，A2=96 h，A3=120 h；發(fā)酵起始 pH 為 B1=6.5，B2=7，B3=7.5；發(fā)酵培養(yǎng)溫度為 C1=25℃，C2=30 ℃，C3=35℃；發(fā)酵培養(yǎng)基中褐藻酸鈉濃度（m/V）為D1=0.1%，D2=0.15%，D3=0.2%。其他條件為氯化鈉濃度2.5%，硫酸銨濃度0.3%，裝液量40 mL（料液比=1∶30），160 r/min 振蕩培養(yǎng)。

由表1可見，最佳褐藻膠降解條件為：A2B3C2D3。由極差分析可以看出，4個因素對菌株W16生長和產酶的影響由大到小次序為：A（發(fā)酵時間）>D（褐藻酸鈉濃度）>B（發(fā)酵起始 pH）>C（發(fā)酵溫度）。因此，A為影響菌株生長和褐藻膠降解能力的最主要因素，其次為誘導物褐藻酸鈉濃度。菌株W16降解褐藻膠的最佳條件為：發(fā)酵時間96 h、發(fā)酵起始pH 7.5、發(fā)酵溫度30℃、褐藻酸鈉濃度0.2%。經正交試驗優(yōu)化后，其發(fā)酵液中褐藻膠相對降解量即OD235為0.531，比優(yōu)化之前的OD235提升了3.29倍。

表1 正交試驗結果

3 結論

本研究采用以褐藻酸鈉為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基，從海泥中篩選出一株能降解海帶褐藻膠的菌株W16，經16SrDNA鑒定，該菌株與芽孢桿菌Bacillus flexus有較高的同源性。經安全性試驗證明，此菌株濃度達到109cfu/mL時對刺參無致病性，可用其降解刺參海帶飼料中的高黏度且不宜被刺參消化的褐藻膠。

為使菌株W16降解海帶飼料中褐藻膠的能力達到最大，進行了發(fā)酵條件優(yōu)化，在單因素試驗基礎上選取對褐藻膠降解量影響較大的4個因素進行了正交試驗，得到菌株W16降解褐藻膠的最佳條件為：發(fā)酵時間96 h、發(fā)酵起始pH 7.5、發(fā)酵溫度30℃、褐藻酸鈉濃度0.2%，另添加0.3%的無機氮源硫酸銨、2.5%的氯化鈉，裝液量40 mL（200 mL搖瓶，20 g海帶粉體系），搖床轉速160 r/min，按1%（V/V）接種量接種。經正交試驗優(yōu)化后，其發(fā)酵液中褐藻膠相對降解量比優(yōu)化之前提高了3.29倍。

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