向玉勇+朱園美+殷培峰

摘要：運用Wrights-Giemsas染色和光學顯微鏡對金銀花尺蠖（Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.）幼蟲血細胞的形態(tài)進行觀察，發(fā)現(xiàn)金銀花尺蠖幼蟲血淋巴中有原血胞、漿血胞、粒血胞、珠血胞、類絳血胞和囊血胞6 種類型的血細胞。

關鍵詞：金銀花尺蠖（Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.）；血細胞；形態(tài)觀察

中圖分類號：Q969.93 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）17-4052-04

Morphological Observation on Larva Hemocytes of Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.

XIANG Yu-yong， ZHU Yuan-mei， YIN Pei-feng

（School of Biology and Food Engineering， Chuzhou University， Chuzhou 239012，Anhui，China）

Abstract： The larva hemocytes morphous of Heterolocha jinyinhuaphaga Chu. was observed with Wright's-Giemsa's stain method and light microscopy technology. The results showed that there were 6 types of hemocytes in larva hemolymph of Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.including prohemocytes， plasmatocytes， granulocytes， spherulocytes， oenocytoids and cystocytes.

Key words： Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.； hemocytes；morphous observation

昆蟲是動物界中最大的類群，在長期進化的過程中形成了一套復雜的免疫系統(tǒng)，對入侵的病原體具有識別和清除能力，主要包括體液免疫和細胞免疫應答[1，2]。血細胞是昆蟲細胞免疫的主要執(zhí)行者，在抵抗病原體入侵的免疫應答過程中發(fā)揮著重要作用。昆蟲種類不同，參與細胞免疫的血細胞種類不同[3]，血細胞的某些生理機能變化常常表現(xiàn)為細胞形態(tài)和組成的變化。因此，研究昆蟲血細胞形態(tài)分類對深入揭示其細胞免疫功能具有重要推動作用。自1669年Swammerdam首次發(fā)現(xiàn)昆蟲的“白”血細胞以來[4，5]，人們對昆蟲血細胞的研究已有 340多年的歷史，涉及蚊（Culicidae）、蠅（Muscidae）、 蚋（Simuliidae）、蜚蠊（Blattaria）、蠶（Bombyx mori）、粘蟲[Mythimna separata（Walker）]等100多種昆蟲[6，7]。由于昆蟲種類繁多，其血細胞形態(tài)各異，甚至同一種昆蟲不同蟲態(tài)、蟲齡在不同生態(tài)、生理條件下的血細胞形態(tài)也存在顯著差異。昆蟲血細胞的分類比較復雜，存在的分歧很多[8]。因此，應對更多種類的昆蟲血細胞形態(tài)進行研究，以豐富其形態(tài)分類。

金銀花尺蠖（Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.）是近年來新發(fā)現(xiàn)的為害金銀花的食葉害蟲之一，該蟲為鱗翅目尺蛾科昆蟲，別名拱腰蟲，在安徽省1年發(fā)生3代[9]，常將葉片咬成缺刻或孔洞，危害嚴重的地塊金銀花葉片被全部吃光，僅剩葉脈和葉柄，常造成金銀花大面積減產(chǎn)，甚至成片死亡，給金銀花生產(chǎn)帶來嚴重損失。目前，國內(nèi)對金銀花尺蠖的研究主要集中在生物學特性及防治方面[9-13]，對其血細胞的形態(tài)學研究尚未見報道。本研究對金銀花尺蠖幼蟲血細胞形態(tài)進行觀察，以期為金銀花尺蠖幼蟲血細胞分類和細胞免疫研究提供試驗依據(jù)， 同時也為金銀花尺蠖的防治提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

從滁州市郊三界鎮(zhèn)野生金銀花上采集金銀花尺蠖幼蟲，帶回實驗室于人工氣候箱（RXZ-288A型，寧波江南儀器制造廠）中用新鮮的金銀花葉片飼養(yǎng)多代，選取老熟幼蟲備用。人工氣候箱光周期（L∶D）為14 h∶10 h，溫度為（25±1） ℃，相對濕度為（70±7）%。

1.2 試劑

Wrights染料（Sigma公司）、Giemsa染料（德國AppliChem公司）、磷酸二氫鉀（廣東西隴化工股份有限公司）、磷酸氫二鈉（廣東西隴化工股份有限公司）、甘油（無錫市晶科化工有限公司）、甲醇（上海凌峰化學試劑有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 染液配制 Wrights染液：稱取Wrights染料粉末0.1 g放在研缽內(nèi)，加入60 mL甲醇充分研磨，使染料全部溶解，然后把溶解的染料倒入干凈的棕色玻璃瓶中，在室溫條件下密封保存，7 d后即可使用。

Giemsa染液：稱取Giemsa粉0.75 g放入研缽中， 加入50 mL甘油， 研磨后置于58 ℃水浴中攪拌加熱90 min，溶入50 mL甲醇中，搖勻后置于37 ℃恒溫箱內(nèi)保溫8～12 h，過濾后置于棕色瓶中密封保存，即為Giemsa原液，12 h后即可使用。臨用時，取1 mL Giemsa原液與10 mL PBS（pH 6.8）混合。

1.3.2 配制1/15 mol/L磷酸緩沖液（PBS）

pH 6.8：稱取磷酸氫二鈉0.47 g，磷酸二氫鉀0.46 g，加入少量去離子水溶解，再定容至1 000 mL。

pH 7.2：稱取磷酸氫二鈉0.68 g，磷酸二氫鉀0.25 g，加入少量去離子水溶解，再定容至1 000 mL。

1.3.3 涂片與觀察 取金銀花尺蠖老熟幼蟲10頭，用無菌水清洗后擦干，用解剖針將其腹部刺破， 用移液器取少量血液，滴在載玻片上涂成血膜，先用Wrights染液將血膜面充分覆蓋，稍等片刻再加Giemsa染液2～3滴，1 min后再緩慢地一滴一滴加磷酸鹽緩沖液（pH 7.2），直至膜面上染色液形成表面張力而終止加入。染色30 min后用自來水緩緩沖洗，涼干封片，在光學顯微鏡（BM2100型，南京江南永新光學有限公司）下觀察。

2 結(jié)果與分析

按照Jones[14]的分類標準，通過光學顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)金銀花尺蠖老熟幼蟲的血細胞包括原血胞、漿血胞、粒血胞、珠血胞、類絳血胞和囊血胞6 種類型。這些血細胞在不同個體間形態(tài)與數(shù)量略有變化。

2.1 原血胞（Prohemocytes，PR）

原血胞也稱為原始血細胞，是數(shù)量較少的小型細胞，呈圓形或卵圓形，輪廓清晰，表面無突起，較光滑。細胞核為單核，紫紅色或紅色，位于細胞中央，比例很大，幾乎充滿整個細胞。細胞質(zhì)比較均勻，僅為薄薄的一層環(huán)繞在核周圍，無明顯顆粒狀物質(zhì)（圖1A）。一般認為此類細胞為原始型，由造血器官或造血組織生成，可分化形成其他類型的血細胞，故名原血胞。

2.2 漿血胞（Plasmatocytes，PL）

漿血胞也稱為原生質(zhì)細胞，有球形、卵形、紡錘形、葉形及不規(guī)則形等多種形態(tài)，且大小不一。細胞核大，單核，位于細胞中央，約占細胞體積的一半。細胞質(zhì)均一，無顆粒內(nèi)含物（圖1 B、圖1C）。

2.3 粒血胞（Granulocytes，GR）

粒血胞是金銀花尺蠖幼蟲血淋巴中普遍存在的一種血細胞，在光學顯微鏡下易于辨識，呈圓形、卵圓形或不規(guī)則形狀。細胞核多為圓形和卵圓形，位于細胞中央，約占細胞體積的一半。細胞質(zhì)內(nèi)含較大的異質(zhì)性溶酶體顆粒，據(jù)此可與漿血胞相區(qū)分（圖1D）。

2.4 珠血胞（Sphrulocytes，SP）

珠血胞多為大中型細胞，呈圓形，細胞內(nèi)有大小不同、數(shù)目不等的珠形內(nèi)含物圍成一圈，細胞核難以觀察到（圖1E）。

2.5 類絳血胞（Oenocytoids，OE）

類絳血胞是金銀花尺蠖幼蟲血淋巴中最大型的血細胞，細胞外形不規(guī)則，細胞核較小，呈圓形，位于細胞的一側(cè)， 有的有2 個核，細胞質(zhì)濃厚而均勻（圖1F）。

2.6 囊血胞（Cystocytes，CY）

囊血胞多為中型細胞，呈圓形或橢圓形，細胞邊緣較光滑，細胞質(zhì)內(nèi)具有大小不一的帶有折光性的顆粒或塊狀物（圖1 G）。

3 討論

昆蟲可產(chǎn)生多種類型的血細胞，通?？捎眯螒B(tài)、組織化學及功能特征來鑒別。血細胞的形態(tài)觀察是研究昆蟲細胞免疫反應的基礎，國內(nèi)的昆蟲學工作者對多種昆蟲血細胞的形態(tài)進行觀察，發(fā)現(xiàn)了在不同種類的昆蟲中存在不同類型的血細胞，如劉玉濱等[15]利用掃描電鏡技術在華北大黑鰓金龜（Holotrichia oblita Fald.）3齡幼蟲血淋巴內(nèi)識別出5種類型的血細胞，分別是原血胞、漿血胞、顆粒血胞、珠血胞和凝血胞；遲淑萍等[16]利用瑞氏染色法在德國小蠊（Blattella germanica）血淋巴中發(fā)現(xiàn)原血胞、漿血胞、顆粒血胞、珠血胞和類絳血胞5種類型的血細胞；王世貴等[17]利用姬姆薩染色和光學顯微鏡在紅褐斑腿蝗（Catantops pinguis）血淋巴中發(fā)現(xiàn)了原血胞、漿血胞、粒血胞、珠血胞和囊血胞5種類型的血細胞；賈雷坡等[18]通過Wrights染色和光學顯微鏡對不同地區(qū)東亞飛蝗[Locusta migratoria manilensis（Meyen）]的血細胞進行觀察，發(fā)現(xiàn)東亞飛蝗的血細胞包括原血胞、漿血胞、粒血胞及類絳血胞4種類型；晏容等[19]應用姬姆薩染色結(jié)合相差顯微鏡及熒光染色方法在家蠅（Musca domestica）3齡幼蟲血淋巴中發(fā)現(xiàn)了原血胞、漿血胞、粒血胞、珠血胞及類絳血胞5種類型的血細胞；魏麗芳等[20]應用熒光顯微鏡和掃描電鏡觀察識別出白蠟綿粉蚧（Phenacoccus fraxinus）血淋巴中有原血胞、漿血胞、粒血胞、類絳色血胞及囊血胞5種類型的血細胞。大量的研究表明，在鱗翅目昆蟲中有原血胞、漿血胞、粒血胞、珠血胞及類絳色血胞5種類型的血細胞[21]，筆者對鱗翅目昆蟲金銀花尺蠖幼蟲血細胞形態(tài)進行觀察，發(fā)現(xiàn)金銀花尺蠖幼蟲體內(nèi)存在原血胞、漿血胞、粒血胞、珠血胞、類絳色血胞及囊血胞6種類型的血細胞，這一結(jié)果進一步說明了不同種類的昆蟲在不同的生長期血細胞種類均有差異。還需進一步對金銀花尺蠖其他蟲態(tài)和不同發(fā)育齡期的血細胞形態(tài)進行觀察比較，從而更加準確地鑒定血細胞的類型。

血細胞在昆蟲免疫中具有重要地位，通過各種血細胞與體液因子的協(xié)同作用，對侵入體內(nèi)的病原體及異物發(fā)生明顯的免疫防御反應。不同的血細胞具有不同的功能，原血胞無吞噬功能，但具有活躍的分裂增殖能力，并可轉(zhuǎn)化為漿血胞，其主要功能為分裂補充血細胞，多數(shù)學者認為此類細胞為原始型，由造血器官或造血組織生成，其他各類血細胞多由其衍生；漿血胞的主要功能是吞噬異物，同時也參與包被和成瘤作用，是主要的防衛(wèi)血細胞，并可轉(zhuǎn)化為粒血胞；粒血胞的主要功能是貯存代謝，此外還參與防衛(wèi)；珠血胞具有貯存和分泌作用，無吞噬功能；類絳血胞無吞噬功能，主要參與物質(zhì)代謝和分泌；囊血胞可能與昆蟲血淋巴的凝集和免疫有關[22，23]。

由于昆蟲的種類不同，對外來入侵物的細胞免疫反應也不盡相同[8]，因此，還需深入研究金銀花尺蠖幼蟲的血細胞在免疫應答中所起的作用，探討其血細胞免疫功能和作用機制，從而為金銀花尺蠖的防治提供理論指導。

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