白雪 盛英杰 蔡雪 王耀 戢新平

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.08.012

基金項目：遼寧省教育廳高等學?？蒲谢鹳Y助項目（L2010682）

作者單位：110004 沈陽，中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院急診科

通信作者：戢新平，Email： jxpwh_ok@163.com

百草枯（paraquat，PQ）又名對草快，其20%的溶液稱克無蹤，是一種有機雜環(huán)類觸殺、滅生型高毒性除草劑。人類誤服百草枯后，無特效解毒劑，中毒病死率極高^[1]，其主要死因早期為急性肺損傷^[2]，后期進展為不可逆性肺纖維化^[3]。百草枯中毒的發(fā)病機制尚未完全清楚^[4]，大量研究顯示細胞凋亡參與百草枯所致的急性肺損傷^[5]。本研究通過建立百草枯中毒大鼠的急性肺損傷模型，初步探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑介導的細胞凋亡在百草枯誘導的大鼠急性肺損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級Spragne-Dawley（SD）大鼠80只，雄性（由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院實驗動物中心提供），體質(zhì)量200～250 g。

1.2 主要試劑與儀器

20%百草枯水溶液購于中國先正達南通作物保護有限公司（用無菌生理鹽水將1 mL克無蹤稀釋至100 mL混勻，配制成2 mg/mL溶液）；兔抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein，GRP78）、兔抗生長停滯和DNA損傷誘導基因153（C/EBP homology protein/growth arrest and DNA damage-inducible gene，CHOP/GADD153）多克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；GAPDH多克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；超敏二步法免疫組化檢測試劑購自中國北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。顯微鏡型號：日本Nikon E800。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與模型建立 根據(jù)預實驗結(jié)果設(shè)計，因染毒組在實驗過程中有死亡，故增加實驗動物數(shù)量，以保證所觀察的各個時間點動物數(shù)量相同。SD大鼠隨機（隨機區(qū)組法）分為對照組（40只）、百草枯染毒組（40只）。①百草枯染毒組（簡稱PQ組）：按20 mg/kg計算，腹腔注射配制的百草枯溶液；②對照組：給予0.9%的無菌生理鹽水（NS）等量腹腔注射。對照組及染毒組于給藥后8 h、1 d、3 d、5 d各處死10只大鼠。左肺用4%多聚甲醛固定，HE染色及免疫組織化學測定；右肺迅速-80 ℃冷凍保存，行Western blot蛋白測定。

1.3.2 病理學檢查 肺組織用4%多聚甲醛溶液固定后，常規(guī)組織脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察肺組織病理改變。

1.3.3 Western blot法檢測GRP78、CHOP蛋白表達 取各組大鼠肺組織各100 mg，加入1 mL組織蛋白裂解液后剪碎組織，勻漿機將組織超聲裂解后，取勻漿液4 ℃15 000 r/min離心20 min。取上清液，BCA法蛋白定量。取50 μg蛋白變性，上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE 凝膠電泳。濕轉(zhuǎn)移法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉封閉1h后，分別加入兔抗大鼠 GRP78 多克隆抗體（1∶ 1 000 稀釋）、兔抗大鼠CHOP多克隆抗體（1∶ 1 000 稀釋）和GAPDH（1∶ 2000稀釋）4 ℃振蕩孵育過夜。TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG（1∶ 2000 稀釋）室溫1 h。TBST洗滌后，利用ECL 超敏發(fā)光液， X 線膠片曝光、顯影。以 GAPDH 為內(nèi)參照。采用分子生物學圖像分析系統(tǒng)進行定量掃描測定條帶灰度值， 將每個樣本的灰度值與相應 GAPDH 的灰度值相比， 計算蛋白的表達水平。

1.3.4 免疫組織化學法檢測GRP78、CHOP蛋白表達 取石蠟切片（4 μm），常規(guī)脫蠟、水化。滴加3%H2O₂去離子水室溫孵育20 min，檸檬酸鹽緩沖液微波加熱修復抗原，滴加一抗（兔抗大鼠GRP78、CHOP多克隆抗體，抗體稀釋的工作濃度均為1∶ 200，另外采用PBS代替一抗的方法制備陰性對照）4 ℃過夜。滴加Polymer Helper的二抗37 ℃ 30 min，滴加poly-HRP anti-Rabbit IgG 37 ℃30 min，DAB顯色，蘇木素復染，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡觀察。顯微鏡下照相，采用全自動圖像分析系統(tǒng)（NIS-Elements Br3.0）分別計算其平均光密度，取其均值分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示， 采用 SPSS 17.0軟件分析，單因素方差分析法比較多個樣本均數(shù)、LSD-t檢驗法進行均數(shù)之間的兩兩比較，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織病理特點

（1）大體觀察：對照組大鼠肺臟呈粉紅色，包膜光滑；染毒組8 h大鼠肺組織局部出現(xiàn)輕度充血，染毒1 d、3 d、5 d大鼠肺組織充血逐漸加重，體積逐漸增大，部分肺呈彌漫性出血，染毒5 d大鼠肺組織有大面積出血點及瘀血。

（2）光鏡觀察：正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清楚，肺泡腔內(nèi)無炎性細胞，肺泡間隔正常，無炎性細胞浸潤及纖維組織增生；染毒8 h大鼠肺組織內(nèi)少量中性粒細胞、巨噬細胞及淋巴細胞，其中以中性粒細胞為主，肺組織結(jié)構(gòu)基本正常；染毒1 d大鼠肺組織炎性細胞浸潤有所增加，部分肺泡間隔斷裂，肺泡腔內(nèi)有紅細胞、水腫液聚集，肺組織結(jié)構(gòu)仍處于正常狀態(tài)。染毒3 d大鼠肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)大量炎性細胞浸潤，肺間隔斷裂明顯，局部出現(xiàn)典型肺大泡表現(xiàn)。染毒5 d炎性細胞浸潤及肺組織結(jié)構(gòu)破壞進一步增加見圖1。

2.2 大鼠肺組織中GRP78、CHOP蛋白表達

對照組8 h、1 d、3 d、5 d中GRP78/GAPDH灰度比值為（0.78±0.0339、0.76±0.0491、0.771±0.0533、0.775±0.0313），PQ組8 h、1 d、3 d、5 d中GRP78/GAPDH灰度比值為（1.361±0.2466、0.936±0.138、0.85±0.0889、0.528±0.1123），E組與A組比較差異具有統(tǒng)計學意義（t=7.92，P<0.05），F(xiàn)組與B組比較差異具有統(tǒng)計學意義（t=2.4，P<0.05），A、B、C、D組間差異無統(tǒng)計學意義。對照組8 h、1 d、3 d、5 d中CHOP/GAPDH灰度比值為（0.6±0.1153、0.61±0.073、0.65±0.019、0.63±0.0993），PQ組8 h、1 d、3 d、5 d中CHOP/GAPDH灰度比值為（2.335±0.0933、1.824±0.1121、1.158±0.0421、0.632±0.0883）。E組與A組比較差異具有統(tǒng)計學意義（t=31.76，P<0.05），F(xiàn)組與B組比較差異具有統(tǒng)計學意義（t=22.23，P<0.05），G與C組比較差異具有統(tǒng)計學意義（t=9.3，P<0.05），A、B、C、D組間差異無統(tǒng)計學意義。對照組GRP78、CHOP蛋白表達水平基本相同，染毒8 h組GRP78、CHOP蛋白表達明顯增加，且隨時間推移，PQ 1 d、3 d、5 d組GRP78、CHOP蛋白表達逐漸下降。 見圖2。2.3 肺組織中GRP78、CHOP蛋白表達水平

免疫組化染色顯示，正常大鼠肺組織中僅有少數(shù)細胞胞漿呈淺黃色，染毒組大鼠肺組織細胞的陽性表達呈棕黃色，較對照組染色明顯增強，且染毒8 h組陽性表達最多，GRP78陽性表達主要位于支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞以及少量的肺血管內(nèi)皮細胞的胞漿內(nèi)。而CHOP陽性表達主要位于支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞的胞核內(nèi)，仍是染毒8 h組陽性表達最多。對照組及染毒組大鼠肺組織中GRP78、CHOP表達具體情況見圖3及表1。E組與A組比較差異具有統(tǒng)計學意義（t=62.36、15.69，P<0.05），F(xiàn)組與B組比較差異具有統(tǒng)計學意義（t=54.3、13.47，P<0.05），G與C組比較差異具有統(tǒng)計學意義（t=50.09、9.8，P<0.05），H組與D組比較差異具有統(tǒng)計學意義（t=39.02、5.91，P<0.05），A、B、C、D組之間差異無統(tǒng)計學意義。見圖4。

3 討論

百草枯中毒引起急性肺損傷的機制十分復雜，近年來研究發(fā)現(xiàn)，肺組織細胞凋亡在百草枯誘導的急性肺損傷中扮演著重要角色。目前已知的細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導存在3條途徑分別為死亡受體活化途徑、線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑。

胡軍利和佟飛等^[6-7]研究發(fā)現(xiàn)百草枯中毒大鼠肺泡巨噬細胞產(chǎn)生大量腫瘤壞死因子（TNF-α），TNF-α與細胞膜上 的腫瘤壞死因子受體（TNFR）結(jié)合啟動死亡受體活化途徑，誘導細胞凋亡。Dinis-Oliveira等^[8]研究發(fā)現(xiàn)，百草枯導致大鼠肺組織P53、AP-1表達增加，造成線粒體膜電位下降，線粒體內(nèi)、外膜之間的通透性轉(zhuǎn)換孔（permeability transition pore，PTP）大量開放，細胞凋亡啟動因子從線粒體釋放，激活caspase-3，誘導細胞凋亡。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑是否參與百草枯誘導的大鼠急性肺損傷在國內(nèi)外文獻中未見相關(guān)報道。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是指多種生理或病理條件引起未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集，損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常生理功能。缺氧、饑餓、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏（包括氨基酸、葡萄糖等）、毒性物質(zhì)（如重金屬）、氧自由基、鈣離子平衡失調(diào)、蛋白質(zhì)糖基化與折疊抑制均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激^[9]。

正常狀態(tài)下，分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78/免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（glucose-regulated protein 78/ binding immunoglobulin protein， GRP78/ BIP）與3個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激感受蛋白[包括抑制物阻抗性酯酶1（Inositol-requiring enzyme 1，IRE-1）、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PKR-like ER kinase，PERK）、活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）]結(jié)合，處于無活性狀態(tài)^[10]。

當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應激狀態(tài)時，GRP78/BIP與3個跨膜應激感受蛋白解離，并與錯誤折疊蛋白或未折疊蛋白結(jié)合，同時解離后的感受蛋白通過各自的信號傳導途徑啟動未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR），減少未折疊或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)累積，促進其降解。因此， ERS標志性蛋白GRP78表達增加一定程度上反映了ERS的啟動^[11]。但過強或持續(xù)時間過長的ERS可激活下游的凋亡信號分子CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/enchancer-binding protein-homologous protein，CHOP），又稱生長停滯和DNA損傷誘導基因153（growth arrest and DNA damage inducible gene 153，GADD153），啟動細胞凋亡。CHOP/ GADD153 是 ER 應激特異的轉(zhuǎn)錄因子，屬于C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員，正常情況下存在于細胞質(zhì)內(nèi)表達量少，但在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激情況下其表達上調(diào)并轉(zhuǎn)位至細胞核，調(diào)控靶基因表達，介導細胞凋亡、調(diào)控細胞分化等^[12-13]。本實驗采用文獻^[14]的方法成功建立百草枯大鼠急性肺損傷模型，通過檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激特異性指標GRP78和CHOP發(fā)現(xiàn)百草枯染毒8 h、1 d組大鼠肺組織中GRP78及CHOP蛋白表達水平明顯增加，提示百草枯誘導大鼠急性肺損傷啟動了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，并且誘導了細胞凋亡的發(fā)生。

百草枯中毒可產(chǎn)生大量活性氧自由基^[4]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對氧化應激反應敏感，其作為活性氧主要攻擊的目標，同時百草枯造成細胞內(nèi)鈣超載，導致鈣穩(wěn)態(tài)失衡^[15]，也可能啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激早期啟動的非折疊蛋白反應，實質(zhì)上屬于一種自我保護機制，在早期干預，可使細胞恢復正常生理功能，由此推測若早期通過藥物干預百草枯造成的肺損傷，能否阻止細胞凋亡的發(fā)生。

參考文獻

[1]Jiang Y， Ma Y， Wang Z， et al. Therapeutic effects of smecta or smectite powder on rats with paraquat toxication[J]. World J Emerg Med，2013，4（2）：144-150.

[2] Meng X， Wang R， Gao S， et al. Effect of ulinastatin on paraquat-induced-oxidative stress in human type Ⅱ alveolar epithelial cells[J]. World J Emerg Med，2013，4（2）：133-137.

[3] 陳麗，錢潔，葉延，等. 百草枯反復小劑量腹腔給藥誘導小鼠肺纖維化模型[J]. 中華急診醫(yī)學雜志，2011，20（12）：1285-1289.

[4] Dinis-Oliveira RJ， Duarte JA， Sanchez-Navarro A， et al. Paraquat poisonings： mechanisms of lung toxicity， clinical features， and treatment[J]. Crit Rev Toxicol，2008，38（1）：13-71.

[5] 張志堅，周從陽. 百草枯對細胞凋亡的影響及藥物干預[J]. 中國工業(yè)醫(yī)學雜志，2010，23（3）：205-207.

[6] 胡軍利，石漢文，田英平，等. 核因子-κB及腫瘤壞死因子-α在百草枯中毒大鼠肺組織中的表達[J]. 中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2011，29（1）：44-48.

[7] 佟飛，劉芙蓉，張建集，等. 百草枯中毒急性肺損傷TNF-α的表達及大黃保護作用的機制[J]. 中華急診醫(yī)學雜志，2009，18（3）：242-246.

[8] Dinis-Oliveira RJ， Sousa C， Remiao F， et al. Sodium salicylate prevents paraquat-induced apoptosis in the rat lung[J]. Free Radic Biol Med，2007，43（1）：48-61.

[9] Osorio F， Lambrecht B， Janssens S. The UPR and lung disease[J]. Semin Immunopathol，2013，35（3）：293-306.

[10]Yoshida H. ER stress and diseases[J]. FEBS J，2007，274（3）：630-658.

[11] Li C， Harada A， Oh Y. IGFBP-3 sensitizes antiestrogen-resistant breast cancer cells through interaction with GRP78[J]. Cancer Lett，2012，325（2）：200-206.

[12] Oyadomari S， Mori M. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress[J]. Cell Death Differ，2004，11（4）：381-389.

[13] Szegezdi E， Logue SE， Gorman AM， et al. Mediators of endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis[J]. EMBO Rep，2006，7（9）：880-885.

[14] 曹鈺，董玉龍，姚堯，等. 急性百草枯中毒所致急性肺損傷機制研究[J]. 中國呼吸與危重監(jiān)護雜志，2005（04）：303-305.

[15] 曹鈺，董玉龍，胡海，等. 鈣穩(wěn)態(tài)失衡在百草枯中毒肺損傷中的作用[J]. 四川醫(yī)學，2005，26（7）：741-743

（收稿日期：2013-12-22）

（本文編輯：何小軍）

P881-884