潘志國 邵玉 萬軍 耿焱 陳鏡合 蘇磊

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.08.008

基金項目：全軍醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究“十二五”發(fā)展計劃重點項目（BWS12J018）；國家自然科學(xué)基金（81071529，81101467，81101406）

作者單位：510010 廣州，廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 全軍熱區(qū)創(chuàng)傷救治與組織修復(fù)重點實驗室

通信作者：蘇磊，Email： slei_icu@163.com

【摘要】目的 研究熱打擊對培養(yǎng)人骨骼肌細(xì)胞（HSKMC）通透性、細(xì)胞骨架及細(xì)胞周期影響。

訪法 流式細(xì)胞儀鈣離子內(nèi)流檢測熱打擊對HSKMC細(xì)胞膜通透性的影響，考馬斯亮藍(lán)R-250染色法檢測熱打擊對HSKMC細(xì)胞骨架影響，流式細(xì)胞儀檢測熱打擊對HSKMC細(xì)胞周期改變。結(jié)果 給予培養(yǎng)人HSKMC細(xì)胞不同溫度梯度熱打擊1 h后， 43 ℃熱打擊組鈣離子流式檢測的中位數(shù)為91.63，37 ℃對照組中位數(shù)為22.98。同對照組相比，隨著熱打擊程度加強(qiáng)，顯微鏡高倍鏡下可見骨骼肌細(xì)胞骨架逐漸出現(xiàn)變粗、變短、出現(xiàn)明顯的應(yīng)力纖維。骨骼肌細(xì)胞在熱打擊情況下，各組G0/G1期DNA含量在44.13～62.98之間，與正常對照組對比，當(dāng)細(xì)胞離開熱打擊環(huán)境后培養(yǎng)18 h前G0/G1期DNA含量明顯高于對照組，培養(yǎng)第18 小時恢復(fù)才同對照組基本相同。

結(jié)論 熱打擊的情況下造成細(xì)胞鈣離子內(nèi)流效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載?？筛淖僅SKMC骨架結(jié)構(gòu)，使骨架失去正常的網(wǎng)狀有序排列結(jié)構(gòu)，間隙增大。細(xì)胞周期出現(xiàn)阻滯，細(xì)胞被阻滯在G0/G1期。

【關(guān)鍵詞】熱打擊；骨骼肌細(xì)胞；通透性；鈣超載；細(xì)胞骨架；細(xì)胞周期；考馬斯亮藍(lán)染色；流式檢測

The effect of heat stress on the permeability， cytoskeleton and cell cycle of human skeletal muscle cellPan Zhiguo， Shao Yu， Wan Jun， Geng Yan， Chen Jinghe， Su Lei.ICU Department of Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command， Guangzhou 510010， China

Corresponding author：Su Lei， Email： slei_icu@163.com

【Abstract】Objective To study the effect of heat stress on the permeability， cytoskeleton and cell cycle of human skeletal muscle cell （HSKMC）. Methods The HSKMC membrane permeability was detected by calcium ion inflow with flow cytometer， the cytoskeleton was stained by CBB 250， and the cell cycle was determined by flow cytometer.Results After 1 h of heat stress on human HSKMC cells under different temperature gradient， the median level of calcium ion was 91.63 in 43 ℃ heat stress group compared with 22.98 in 37 ℃control group. As temperature increased， thicker and shorter cytoskeleton and stress fiber were shown under the high power lens of microscope. The DNA expression of skeleton cells at G0/G1 stage was 44.13-62.98 in groups under heat stress. Compared with normal control group， DNA expression was much higher in heat stress group， when HSKMC was cultured under 37℃ temperature for another 18 h， it kept decreasing DNA expression to a similar level as control group.Conclusions Heat stress can cause calcium iron inflow resulting in intracellular calcium overload， and affect the cytoskeleton leading to loss of normal web ordered arrangement and increased gap in HSKMC cells， which give rise to blocking cell cycle into G0/G1 stage.

【Key words】Heat stress；Skeletal muscle cells；Permeability；Calcium overload；Cytoskeleton；Cell cycles；Coomassie brilliant blue； Coomassie brilliant blue；Flow cytometry

中暑的特征為中心體溫過高伴隨著系統(tǒng)炎癥反應(yīng)致多臟器功能障礙，患者中心體溫可超過40 ℃，導(dǎo)致機(jī)體主要臟器如心、肝、肺、腎、腸、血管和骨骼肌等發(fā)生一系列損傷^[1-7]。中暑并發(fā)橫紋肌溶解癥的發(fā)病率約為25%^[8]。骨骼肌占成人體質(zhì)量的40%～50%，骨骼肌細(xì)胞內(nèi)外的電解質(zhì)失衡、炎癥因子變化對整個機(jī)體的影響十分巨大。本課題組前期實驗證實熱打擊對骨骼肌細(xì)胞具有細(xì)胞毒效應(yīng)，抑制骨骼肌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的釋放，提出重癥中暑的“第二關(guān)鍵點”理論^[9-10]。筆者在前期的研究中發(fā)現(xiàn)熱打擊是導(dǎo)致橫紋肌溶解的重要原因^[11-12]，本實驗擬通過研究在熱打擊條件下骨骼肌細(xì)胞的鈣離子內(nèi)流情況、細(xì)胞骨架改變和細(xì)胞周期變化情況，觀察熱打擊對于骨骼肌細(xì)胞的影響，進(jìn)一步研究骨骼肌在重癥中暑發(fā)生、發(fā)展中的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

人骨骼肌細(xì)胞株（HSKMC）從中國科學(xué)院昆明細(xì)胞所購買。流式細(xì)胞儀購自BD公司，F(xiàn)luo-3 AM鈣離子熒光探針試劑盒購自invitrogen公司，Olympus熒光顯微鏡，細(xì)胞周期與凋亡檢測試劑盒購自武漢碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 HSKMC細(xì)胞培養(yǎng) HSKMC細(xì)胞復(fù)蘇后，將細(xì)胞收入離心管中，1000 r/min離心10 min，棄上清，用高糖DMEM培養(yǎng)液（含20%胎牛血清，10 0000 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素）混勻細(xì)胞，轉(zhuǎn)入25 mL玻璃培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO₂濃度及飽和濕度條件下培養(yǎng)，次日換液，以后根據(jù)細(xì)胞生長情況每48～72 h更換培養(yǎng)液一次，每周傳代1～2次。

1.2.2 流式細(xì)胞儀鈣離子內(nèi)流檢測熱打擊對HSKMC細(xì)胞膜通透性的影響 將Fluo-3AM鈣離子熒光探針溶于1 mL DMSO中，制成1 μg/μL，取對數(shù)生長期細(xì)胞，按1×10⁴個/皿密度鋪入60 mm×15 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至單層融合后，給予消化，然后將懸浮液按下述方法給予刺激：①對照組（即將細(xì)胞置于標(biāo)準(zhǔn)37 ℃、5%CO₂濃度培養(yǎng)箱中同其余各組等時間培養(yǎng)）；②43 ℃熱打擊組（將細(xì)胞置于43 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h）。打擊后同一時間每瓶懸浮液按2 μL/100 μL加入Fluo-3AM鈣離子熒光探針，置于標(biāo)準(zhǔn)37 ℃、5%CO₂濃度培養(yǎng)箱共同避光孵育1 h，予以上機(jī)檢測。

1.2.3 考馬斯亮藍(lán)R-250染色法檢測熱打擊對HSKMC細(xì)胞骨架影響 取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化后按5×10³個/片密度鋪入6孔板培養(yǎng)玻片，培養(yǎng)至單層融合后，按下述方法給予刺激：①對照組（即將細(xì)胞置于標(biāo)準(zhǔn)37 ℃、5%CO₂濃度培養(yǎng)箱中同其余各組等時間培養(yǎng)）；②43 ℃熱打擊組（將細(xì)胞置于43 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h）。應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)R250染色：①配制M-緩沖液；②傾棄培養(yǎng)上清，加入1 mL PBS沖洗3次；③吸去PBS，用1.5%TritonX-100搖床震蕩處理8 min，3次；④吸去TritonX-100，用M-緩沖液搖床震蕩洗4次，每次3 min；⑤用3%戊二醛固定10 min，給予M-緩沖液洗3次，每次3 min；⑥用0.2%考馬斯亮藍(lán)R250震蕩染色40 min；⑦蒸餾水洗3次，每次孵箱烘干；⑧然后將細(xì)胞玻片置于載玻片上，加蓋玻片，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察；⑨如染色效果好，可用二甲苯處理樣品，5 min，兩次，最后一次不要等樣品干；⑩加一滴中性樹膠，加蓋玻片封片，制成永久切片。普通光學(xué)顯微鏡高倍鏡下照片。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測熱打擊對HSKMC細(xì)胞周期改變 取對數(shù)生長期細(xì)胞，按1×10⁴個/皿密度鋪入60 mm×15 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至單層融合，按下述方法給予刺激：①對照組（即將細(xì)胞置于標(biāo)準(zhǔn)37 ℃、5%CO₂濃度培養(yǎng)箱中同其余各組等時間培養(yǎng)）；②43 ℃熱打擊組（將細(xì)胞置于43 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h）。將43 ℃熱打擊組繼續(xù)置于標(biāo)準(zhǔn)37 ℃、5%CO₂濃度培養(yǎng)箱孵育，于0、6、18、24 h分別取出后消化，用胰酶消化細(xì)胞，至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。具體操作按武漢碧云天公司細(xì)胞周期與凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行。染色完成后在24 h內(nèi)完成流式檢測。用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488 nm波長處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。采用適當(dāng)分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析。

2 結(jié)果

2.1 熱打擊對HSKMC細(xì)胞膜通透性的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示，給予培養(yǎng)人HSKMC細(xì)胞不同溫度梯度熱打擊1 h后，如圖1所示，43 ℃熱打擊組鈣離子流式檢測的中位數(shù)為91.63，37 ℃對照組中位數(shù)為22.98。

2.2 熱打擊對HSKMC細(xì)胞骨架影響

本實驗中，同對照組相比，隨著熱打擊程度加強(qiáng)，顯微鏡高倍鏡下可見骨骼肌細(xì)胞骨架逐漸出現(xiàn)變粗、變短、出現(xiàn)明顯的應(yīng)力纖維，見圖2。

2.3 熱打擊對HSKMC細(xì)胞細(xì)胞周期改變

同正常對照組相比，骨骼肌細(xì)胞在熱打擊情況下，DNA含量與細(xì)胞周期中各期百分構(gòu)成比統(tǒng)計結(jié)果分別見圖3及表1。3 討論

胞漿Ca²+是細(xì)胞的第2信使。細(xì)胞內(nèi)鈣不僅作為一種重要的第2信使廣泛參與細(xì)胞的運(yùn)動、分泌、代謝和分化等多種細(xì)胞功能活動的調(diào)節(jié)，而且胞內(nèi)鈣離子濃度的變化與調(diào)控對于參與維持存在于細(xì)胞質(zhì)膜或細(xì)胞器膜兩側(cè)的跨膜梯度差，以及介導(dǎo)細(xì)胞對外界刺激的應(yīng)答反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用^[13]。研究發(fā)現(xiàn)， 鈣在細(xì)胞損傷過程中起重要作用，各種因素導(dǎo)致的細(xì)胞或細(xì)胞器內(nèi)鈣過度集聚可引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損害，線粒體和細(xì)胞內(nèi)鈣異常增加程度常作為細(xì)胞損傷指征之一^[14]。

引起橫紋肌溶解的一個重要的理論就是線粒體Ca²+超載導(dǎo)致線粒體功能障礙^[15]。細(xì)胞內(nèi)外的Ca²+水平變化是微小和迅速的，極難測定，目前定量這些變化在技術(shù)上仍存在一定困難^[16]。通過測定熒光強(qiáng)度來反映細(xì)胞中的鈣離子濃度是目前普遍采用的細(xì)胞內(nèi)鈣離子檢測方法。本實驗通過應(yīng)用流式細(xì)胞儀及Fluo-3/AM檢測不同溫度熱打擊后細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化。本實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)luo-3/AM負(fù)載的HSKMC細(xì)胞在37 ℃基礎(chǔ)狀態(tài)下就有少量鈣離子內(nèi)流，但隨著熱打擊溫度及時間延長，43 ℃熱打擊組鈣離子流式檢測的中位值為91.63，而37 ℃對照組中位值僅為22.98，提示細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯增加，說明在熱打擊的情況下造成細(xì)胞鈣離子內(nèi)流效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，最終導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞損傷、壞死。

細(xì)胞骨架是細(xì)胞內(nèi)不同蛋白質(zhì)纖維的聚合物和各種調(diào)控蛋白交錯連接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，它參與細(xì)胞分裂及運(yùn)動、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)榷喾N功能，在維持真核細(xì)胞的形態(tài)、承受外力、胞內(nèi)運(yùn)輸、變形運(yùn)動、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮著重要的作用，而且還參與許多重要的生命活動，包括染色體分離、細(xì)胞中各類小泡和細(xì)胞器的定向轉(zhuǎn)運(yùn)以及白細(xì)胞遷移、精子游動、神經(jīng)細(xì)胞軸突伸展等^[17-18]。一般而言，應(yīng)力纖維是支撐細(xì)胞形態(tài)的主要結(jié)構(gòu)，其表達(dá)的改變往往代表細(xì)胞的變形和增殖等變化^[19]。本實驗通過應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)R250染色法檢測熱打擊對HSKMC細(xì)胞骨架影響，隨著熱打擊時間及程度加強(qiáng)，同對照組相比，顯微鏡高倍鏡下可見HSKMC細(xì)胞骨架逐漸出現(xiàn)變粗、變短，出現(xiàn)明顯的應(yīng)力纖維。提示熱打擊可改變HSKMC骨架結(jié)構(gòu)，增加HSKMC通透性，同時使骨架失去正常的網(wǎng)狀有序排列結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞收縮，使HSKMC間隙增大，最終會導(dǎo)致HSKMC結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)改變。

多細(xì)胞有機(jī)體的發(fā)生與發(fā)育有賴于細(xì)胞增殖、分化和死亡的精密結(jié)合， 即細(xì)胞周期的正常運(yùn)行。本研究通過流式細(xì)胞儀檢測熱打擊后骨骼肌細(xì)胞細(xì)胞周期分布，發(fā)現(xiàn)骨骼肌細(xì)胞在熱打擊情況下，各組G0/G1期DNA相對含量在44.13～62.98之間，與正常對照組對比，當(dāng)細(xì)胞離開熱打擊環(huán)境后培養(yǎng)18 h前G0/G1期DNA相對含量明顯高于對照組，培養(yǎng)第18小時才恢復(fù)同對照組基本相同，說明熱打擊情況下，細(xì)胞周期出現(xiàn)阻滯，細(xì)胞被阻滯在G0/G1期，細(xì)胞內(nèi)部活動減緩，處于“休眠”狀態(tài)，不能進(jìn)一步發(fā)展到S期和G2/M期，從而不能完成整個細(xì)胞的分裂過程，大約18 h左右才恢復(fù)至正常狀態(tài)。

參考文獻(xiàn)

[1]Glazer JL. Management of heatstroke and heat exhaustion[J]. Am Fam Physician，2005，71（11）：2133-2140.

[2] Carter RR， Cheuvront SN， Williams JO， et al. Epidemiology of hospitalizations and deaths from heat illness in soldiers[J]. Med Sci Sports Exerc，2005，37（8）：1338-1344.

[3] 劉志鋒，唐柚青，徐秋林，等. 熱打擊后小鼠肺和腦組織病理學(xué)的改變[J]. 中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2011，20（6）：623-626.

[4] 肖桂珍，蘇磊. 中暑時腸黏膜機(jī)械屏障功能的變化[J]. 中國危重病急救醫(yī)學(xué)，2012，24（9）：568-570.

[5] 潘志國，邵玉，劉亞楠，等. 重癥中暑患者入院早期凝血功能指標(biāo)與預(yù)后的關(guān)系[J]. 中華危重病急救醫(yī)學(xué)，2013，25（12）：725-728.

[6] 肖桂珍，袁芳芳，古正濤，等. 二十碳五烯酸對熱打擊后腸上皮細(xì)胞的影響[J]. 感染、炎癥、修復(fù)，2013，14（1）：11-14.

[7] 耿焱，彭娜，劉亞楠，等. 熱打擊對培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響[J]. 感染、炎癥、修復(fù)，2013，14（1）：7-10.

[8] Kozack J K， Macintyre D L. Malignant hyperthermia[J]. Phys Ther，2001，81（3）：945-951.

[9] 潘志國，耿焱，劉灝，等. 熱打擊對培養(yǎng)人骨骼肌細(xì)胞的損傷和釋放IL-6、TNF-α的影響[J]. 實用醫(yī)學(xué)雜志，2012（9）：1405-1407.

[10]蘇磊. 重癥中暑防治回顧與啟示[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2011（9）：883-885.

[11] 蘇磊，孟繁蘇. 橫紋肌溶解的病理生理及診治[J]. 中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2007，16（11）：1231-1232.

[12] 周偉梁，張濤，蘇磊. 中暑與橫紋肌溶解及膿毒癥的關(guān)系[J]. 中國全科醫(yī)學(xué)，2006，9（20）：1738-1739.

[13] Loughrey CM， Maceachern KE， Cooper J， et al. Measurement of the dissociation constant of Fluo-3 for Ca²+ in isolated rabbit cardiomyocytes using Ca²+ wave characteristics[J]. Cell Calcium，2003，34（1）：1-9.

[14] 張旭，梅曉云，卞慧敏，等. 骨骼肌細(xì)胞損傷模型的建立[J]. 解放軍藥學(xué)學(xué)報，2003（02）：85-86.

[15] 潘志國，蘇磊，孟繁甦. 橫紋肌溶解癥病理生理及其與膿毒癥關(guān)系[J]. 嶺南急診醫(yī)學(xué)雜志，2008，13（5）：398-399， 402.

[16] Sobie EA， Kao JP， Lederer WJ. Novel approach to real-time flash photolysis and confocal [Ca²+] imaging[J]. Pflugers Arch，2007，454（4）：663-673.

[17] Akhmanova A， Steinmetz MO. Tracking the ends： a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips[J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9（4）：309-322.

[18] Pellegrin S， Mellor H. Actin stress fibres[J]. J Cell Sci，2007，120（Pt 20）：3491-3499.

[19] Svoboda KK， Orlow DL， Ashrafzadeh A， et al. Zyxin and vinculin distribution at the cell-extracellular matrix attachment complex （CMAX） in corneal epithelial tissue are actin dependent[J]. Anat Rec，1999，254（3）：336-347.

（收稿日期：2014-01-17）

（本文編輯：何小軍）

P862-865