李嫣 樊毫軍 侯世科 丁輝

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.09.013

基金項目：武警總部科研課題（WJHQ2010-08）

作者單位：300162 天津，中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫(yī)院呼吸科（李嫣），醫(yī)教部（樊毫軍、侯世科、丁輝）

通信作者：樊毫軍，Email：fanhaojun999@126.com

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是指嚴重感染、創(chuàng)傷、休克等打擊后，出現(xiàn)以肺泡毛細血管損傷導致肺水腫和肺不張為病理特征的綜合征^[1]。中重度熱煙霧致吸入性肺損傷作為一種特殊類型的ALI/ARDS，目前治療仍然主要是肺保護性通氣、液體支持療法、控制感染、抗炎因子、應用皮質(zhì)激素和血管擴張劑等的治療，其病死率仍在23%以上^[2]。美國國家健康組織估計ARDS/ALI的發(fā)病率約有75/100 000，病死率甚至高達40%～60%^[3]。肺損傷主要是血清和肺泡腔內(nèi)促炎因子如IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β的升高^[4]，伴有肺泡上皮細胞、內(nèi)皮的損傷以及肺泡毛細血管屏障的減弱。臍帶源性間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）不但能夠成為骨髓MSCs的理想替代物，而且具有來源豐富、取材方便，MSCs含量豐富、獲得率高，多向分化潛能、增殖能力強和低免疫原性、低病毒感染率等優(yōu)點；同時還克服了骨髓源MSCs隨年齡增長或老化而增殖能力和分化能力下降^[5]等缺點。因此，本文將通過研究人臍帶間充質(zhì)干細胞（ human umbilical cord derived mesenchymal stem cells，u-MSCs）移植于熱煙霧致肺損傷大鼠的組織修復機制，為人ALI的治療提供新的治療方案。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SPF級Wistar大鼠72只，體質(zhì)量（200±10）g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。

1.2 實驗設備

熒光倒置顯微鏡（奧林巴斯 IX71），全自動脫水機（久圣，JTS-120P），組織包埋機（久圣，JBM-B），輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機（萊卡，RM2245），組織挪片機（久圣，TP-D），組織烘片機（久圣，HP-D），無菌解剖剪、鑷子、手術刀、眼科剪等（上海醫(yī)療器械（集團）有限公司手術器械廠）

1.3 實驗試劑

5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）、SP組化試劑盒（北京優(yōu)博奧公司）、DAB顯色試劑盒（博士德生物工程有限公司）、兔抗鼠水通道蛋白-5（aquaporin，AQP-5）、兔抗鼠堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、兔抗鼠角蛋白（武漢博士德）、Polymer免疫組化雙染試劑盒DS-0001（北京中杉金橋生物技術有限公司）、4%中性多聚甲醛固定液（Solarbio）。

1.4 實驗方法

64只大鼠隨機（隨機數(shù)字法）分為A組正常對照組，靜注生理鹽水1 mL；B組實驗對照組，靜注1×106個u-MSCs的PBS 1 mL；C/D組熱煙霧吸入損傷后2 h 靜注/經(jīng)氣管滴入PBS 1 mL；E/F組熱煙霧吸入損傷后2 h 經(jīng)靜脈注射/經(jīng)氣管滴入含1×106個u-MSCs的PBS 1 mL。致傷前每只大鼠自由攝食、飲水及活動。參照文獻[6]制備熱煙霧致大鼠ALI模型，并參照該文獻評估致傷模型是否成功，致傷成功2 h后經(jīng)氣管及靜脈注射三代u-MSCs（u-MSCs由武警總醫(yī)院中心實驗室細胞培養(yǎng)室贈送），移植前用熒光染料BrdU（10 mg/L）與三代u-MSCs 共培養(yǎng)72 h，并經(jīng)細胞爬片免疫組化證實標記是否成功。

1.5 實驗取材及檢測指標

各組分別在移植u-MSCs后12 h、24 h、1周時間點分別處死4只。（1）標本留取：開胸，迅速取氣管、肺及心肝腎，甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，倒置顯微鏡觀察。參照文獻[7]進行肺損傷Smith評分。對肺不張、肺水腫、肺泡及間質(zhì)出血、肺泡及間質(zhì)炎癥和透明膜，依次行0至4分計分：正常記為0分，病變范圍小于1/4記為1分、1/4至1/2之間記為2分、1/2至3/4之間記為3分、整個視野記為4分，上述5項之和記為總肺損傷評分。每個標本取10個視野（×400倍），取其均數(shù)。（2）免疫組化染色顯示u-MSCs在大鼠體內(nèi)分布：將切片浸在3%H2O2新鮮配制的甲醇溶液中孵育，高壓抗原修復，加入足量兩種一抗混合物于切片上（BrdU、人水通道蛋白5、堿性磷酸酶、以及角蛋白抗體稀釋度均為1∶ 100），孵育。每張切片加入混合二抗，濕盒中室溫孵育。滴加DAB液，鏡下觀察切片顯色情況。滴加AP-Red工作液，孵育后，鏡下觀察顯色情況。滴加封片劑，水平放置，完全變干后顯微鏡觀察并拍照。

1.6 統(tǒng)計學方法

計量資料均以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計描述、數(shù)據(jù)處理。不同時間點各組比較采用重復測量的方差分析；同一時間點不同組之間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著差法（LSD-t）。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠氣管、肺及心肝腎病理觀察

給予u-MSCs對正常大鼠肺臟無明顯影響，A、B兩組在三個時間點鏡下觀肺、氣管、心肝腎屬于正常結構。而熱煙霧吸入后u-MSCs移植可顯著改善肺病理性損傷，12 h、24 h、1周肺組織逐漸好轉(zhuǎn)。經(jīng)氣管及靜脈輸入u-MSCs組在12 h、24 h均表現(xiàn)為可見少量支氣管上皮細胞脫落至肺泡腔內(nèi)，肺泡及支氣管周圍的中性粒細胞浸潤較損傷組減少。氣管黏膜上皮少許脫落，并可見少許血管擴張。1周肺泡融合較損傷組減少，肺泡間隔變寬不明顯，肺水腫和肺不張也較損傷組改善。肺泡腔內(nèi)中性粒細胞和紅細胞數(shù)量較損傷組明顯減少。氣管結構相對更加完整，上皮脫落數(shù)量明顯減少，炎癥細胞浸潤也明顯減少，較損傷組明顯減輕。

各時間點肺組織損傷評分見表1。方差齊性檢驗提示方差齊（F=0.680，P=0.554）。其中A與B組評分組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05 ）；而E組較C組低、F組較D組低、E組較F組低、差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05 ）。

2.2 免疫組織化學染色顯示u-MSCs在大鼠體內(nèi)分布

ABCD組未見陽性細胞（BrdU標記u-MSCs陽性即細胞核呈棕褐色）。E組和F組顯示出BrdU標記的u-MSCs在熱煙霧致肺損傷后2 h 經(jīng)靜脈和氣管移植入大鼠體內(nèi)，在12 h時間點能在損傷的肺和氣管組織中找到少量陽性細胞；1周陽性細胞數(shù)依次較24 h多；在1周正常的心、肝、腎組織中可觀察到少許陽性細胞（圖1）。

2.3 免疫組織化學雙染色顯示u-MSCs分化為肺泡上皮細胞

在E、F組1周可見AQP-5、AKP、角蛋白和BrdU雙染陽性細胞，即肺泡Ⅰ型、Ⅱ型上皮細胞膜和氣管上皮細胞膜染為紅色，細胞核染為棕黃色，說明u-MSCs在肺內(nèi)能分化為肺泡Ⅰ型、Ⅱ型上皮細胞，在氣管內(nèi)能分化為氣管上皮細胞（圖2）。

3 討論

迄今研究表明，ALI/ARDS的重要病理特征是肺血管通透性增加造成的肺水腫。肺泡上皮細胞的肺泡液體清除作用（alveolar fuid clearance，AFC）是機體清除肺泡內(nèi)多余液體的重要途徑，肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮細胞，尤其是后者與AFC關系最為密切。Matthay和Wierer^[8]第一次臨床證實ALI/ARDS患者存在AFC功能障礙。因此，熱煙霧吸入致大鼠ALI/ARDS的主要治療應該是肺的功能細胞AT Ⅰ和AT Ⅱ以及氣管、支氣管的修復治療。本實驗采用免疫組化雙染色，分別選擇了AT Ⅰ和AT Ⅱ及氣管上皮的特征性標記物水通道蛋白-5（AQP-5）、堿性磷酸酶、角蛋白（keratin）進行檢測。綜合考慮實驗結果，認為u-MSCs可能通過以下方面發(fā)揮作用： （1）在體內(nèi)能分化為肺泡Ⅰ型上皮細胞；（2）還可能分化為肺泡Ⅱ型上皮細胞；（3）在氣管內(nèi)能分化為氣管上皮細胞；即u-MSCs移植能促進肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮細胞及氣管上皮再生， 促進肺及氣管組織恢復。同時，肺損傷大鼠移植u-MSCs后，明顯降低肺損傷Smith評分，不僅如此，本研究在u-MSCs移植后1周大鼠ALI模型中，心、腎、組織中均可檢測到BrdU標記的陽性細胞，這與國內(nèi)其他研究相似^[9]。但是對于這種表達了陽性細胞的心、肝、腎，筆者目前只進行了病理組織切片，未發(fā)現(xiàn)明顯異常，對于u-MSCs對心、肝、腎組織的長期影響，以及是否會產(chǎn)生腫瘤組織，尚有待下一步實驗研究。

關于u-MSCs促進ALI/ARDS的組織修復的機制，首先是u-MSCs的多向分化潛能和“歸巢”機制，學者公認MSCs具有多向分化潛能。大量研究顯示MSCs能“歸巢”至肺損傷和炎癥區(qū)域，分化成為肺泡上皮細胞或肺血管內(nèi)皮細胞等，這是發(fā)揮其功能的前提。肺損傷后，壞死肺組織細胞可能通過釋放出一系列信號因子，引導表達特異性受體的干細胞移動并黏附于損傷處，這被認為是干細胞“歸巢”的最主要機制?；|(zhì)細胞衍生因子-1（stromal cell derived factors， SDF-1）及其受體CXCR4、受體c-kit、集落刺激因子、血管內(nèi)皮生長因子和整合素等，大量細胞因子、蛋白水解酶及黏附分子等可能也參與了此過程^[10]。Rojas等^[11]發(fā)現(xiàn)MSCs對博萊霉素所致的肺損傷具有保護作用，同時伴有循環(huán)中粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）和粒細胞巨核細胞集落刺激因子（granulocytemegakaryocyte colony stimulating factor，GM-CSF）（兩者被認為可以促進內(nèi)源性干細胞的動員和遷移）的升高及炎性因子的降低，這種保護作用可能與u-MSCs分化為ATⅠ和ATⅡ有關。

實驗中，需要決定細胞遞送的合適的計量和途徑。實驗中應用的劑量范圍是每個動物（主要是鼠）5×105 到5×106 個細胞，劑量反應并未報道，所以鼠的合適的劑量尚不知。目前有研究證實106是細胞移植較為理想的濃度^[12]，因此本實驗采取經(jīng)氣管及靜脈輸注1×106個細胞。另外，經(jīng)靜脈和經(jīng)氣管途徑注入都被證明有效。每種途徑都有優(yōu)點，經(jīng)氣管途徑可以在纖維支氣管鏡下進行，可以明確瞄準肺內(nèi)受損的區(qū)域。另外，經(jīng)靜脈途徑可以提供更大的全身的系統(tǒng)的作用，減輕ALI經(jīng)常伴有的多器官功能障礙。

但u-MSCs移植的上限濃度及最佳移植濃度， 以及如何保證 u-MSCs移植后的存活率及調(diào)節(jié)其向肺泡上皮細胞及氣管上皮細胞的比例， 使其對熱煙霧致肺損傷發(fā)揮最佳的修復作用，尚需進一步研究證實。國內(nèi)有研究證實靜脈移植的MSCs能歸巢至煙霧吸入性肺損傷炎癥反應明顯的肺組織和氣管組織，并分化成肺泡Ⅰ型、Ⅱ型和肺血管內(nèi)皮細胞，可能參與了煙霧吸入性損傷的組織修復過程^[13]。Ortiz等^[14]證明在博來霉素致大鼠ALI后立即氣管內(nèi)或全身輸入MSCs能減少隨后的膠原沉著、纖維化及基質(zhì)金屬蛋白酶水平。不同時間點向博來霉素致肺損傷的大鼠輸注MSCs后均能減輕肺纖維化的程度，而早期輸入MSCs效果尤佳。因此本研究在熱煙霧致大鼠ALI后2 h給予氣管內(nèi)及靜脈輸入u-MSCs。Ortiz等^[14]實驗證明經(jīng)氣管移植MSCs，MSCs在肺的歸巢和移植可能會因為透明質(zhì)酸和骨橋蛋白質(zhì)與CD44受體的結合而增加。博來霉素處理后可以增加肺組織的透明質(zhì)酸的表達，在這些條件下，骨橋蛋白質(zhì)mRNA水平也增加。免疫浸潤細胞釋放的細胞因子和絲裂原可能影響歸巢、移植和MSCs的增殖狀況。最后，博來霉素毒性致微血管系統(tǒng)的破壞也提供了一個非特異性機制，即MSCs獲得了與肺組織的接觸的增加。

綜上所述，u-MSCs促進并參加ALI/ARDS的肺組織的修復過程，盡管這一機制的研究尚不深入，但是修復后的肺泡上皮細胞的液體清除率及氣體交換功能是否保留，或者這種功能是增加還是減退，尚需要進一步探索證實。

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（收稿日期：2014-01-30）

（本文編輯：鄭辛甜）

P1001-1005