毛曉光，譚 湘，楊志偉，王燕穎

1.黑龍江省醫(yī)院普外科，黑龍江 哈爾濱 150036;2.新疆阿勒泰地區(qū)富蘊(yùn)縣人民醫(yī)院內(nèi)科

大腸癌(colorectal cancer)是大腸黏膜上皮和腺體發(fā)生的惡性腫瘤。在全球最常見的惡性腫瘤中，大腸癌的發(fā)病率高居第4位。近年來我國大腸癌的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢。而腫瘤晚期的轉(zhuǎn)移，已成為大腸癌高死亡率的主要原因。因此，大腸癌早期診斷，對改善患者的治療及預(yù)后具有極其重要的意義，而新的腫瘤標(biāo)志物的識(shí)別對癌癥的早期診斷和治療具有重要的臨床意義。髓過氧化物酶(MPO)是一種糖蛋白，又是活化多環(huán)芳烴類致癌物的代謝酶[1]，具有腫瘤細(xì)胞毒作用。血小板源性生長因子 D(PDGF-D)是PDGF家族的新成員，它參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)過程，對腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、血管形成都有促進(jìn)作用[2]。本研究采用免疫組化的方法檢測在研究大腸癌及大腸腺瘤中PDGF-D和MPO的表達(dá)，以探討其在結(jié)腸癌中的發(fā)生與臨床病理因素之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集黑龍江省醫(yī)院2012年1月－2013年4月消化內(nèi)科內(nèi)鏡中心活檢和住院手術(shù)患者的石蠟包埋組織標(biāo)本160例，其中大腸癌88例，大腸腺瘤72例，所有標(biāo)本均已經(jīng)病理證實(shí)。88例大腸癌組織中，男50例，女38例，平均年齡(63.2±5.1)歲。根據(jù)組織學(xué)形態(tài)用三級(jí)分法來判斷浸潤癌的分化程度，Ⅰ級(jí)為高分化，Ⅱ級(jí)為中分化，Ⅲ級(jí)為低分化。其中高分化癌7例，中分化癌47例，低分化癌34例。72例大腸腺瘤組織中，男39例，女33例，平均年齡(58.4±6.3)歲;兔抗人MPO多克隆抗體;免疫組化試劑盒及DAB顯色劑購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;PDGF-D山羊抗人抗體購自美國R＆D公司。

1.2 方法 石蠟包埋的組織連續(xù)切片4 μm的厚度，切片常規(guī)脫蠟和水化后，對組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)。采用二步法染色步驟將每張切片加1滴3%H2O2，室溫下孵育10 min后，PBS緩沖液洗3 min×3次。除去PBS液，每張切片滴加一抗工作液(兔抗人MPO，山羊抗人PDGF-D)，在室溫下孵育1 h。PBS緩沖液洗3 min×3次。滴加Max Vision試劑，在室溫下孵育15 min。緩沖液洗3 min×3次。除去PBS液，滴加DAB溶液，在室溫下孵育10 min。自來水充分沖洗、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片、光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 染色結(jié)果判定 為證實(shí)在免疫組化染色中所用第一抗體的有效性和可靠性設(shè)立同步免疫染色對照，采用空白對照:以緩沖液PBS取代第一抗體，其他各步不變的試劑對照染色，結(jié)果為陰性。已知陽性切片為陽性對照。每例隨機(jī)觀察10個(gè)視野，依照陽性細(xì)胞數(shù)量，可分為:弱陽性(+:指陽性細(xì)胞總數(shù)在25%以下);中等陽性(++:指陽性細(xì)胞總數(shù)在25～49%);強(qiáng)陽性(+++:指陽性細(xì)胞總數(shù)在50%以上)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)計(jì)算陽性率、樣本率的比較采用卡方檢驗(yàn)，兩個(gè)變量之間的相關(guān)性測試由Spearman等級(jí)相關(guān)分析。計(jì)量資料用表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDGF-D、MPO蛋白的表達(dá) MPO陽性表達(dá)以細(xì)胞膜和細(xì)胞漿出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞(見圖1)。PDGF-D陽性表達(dá)以細(xì)胞漿出現(xiàn)深棕色顆粒為陽性細(xì)胞(見圖2)。PDGF-D在大腸癌及大腸腺瘤組織中均有部分呈陽性表達(dá)，大腸癌中陽性表達(dá)75例;大腸腺瘤中陽性表達(dá)25例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=43.10，P ＜0.01)，MPO 在大腸癌中陽性表達(dá)56 例，大腸腺瘤中20例。采用卡方檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.42，P ＜0.01)。PDGF-D 與 MPO 在大腸腺瘤組織中的表達(dá)，與大腸癌組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

圖1 MPO在大腸癌中的表達(dá)(400×);圖2 PDGF-D在大腸癌中的表達(dá)(400×)Fig1 Expression of MPO in colorectal cancer tissues(400×);Fig2 Expression of PDGF-D in colorectal cancer tissues(400×)

表1 PDGF-D與MPO在大腸癌及大腸腺瘤中的表達(dá)Tab1 Expression of PDGF-D and MPO in colorectal adenomas and colorectal cancer

2.2 PDGF-D和MPO在大腸癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 PDGF-D和MPO在大腸癌組織中的表達(dá)與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P＜0.05)。PDGFD和MPO在大腸癌組織中的表達(dá)與性別、年齡及組織分化程度均無相關(guān)性(P＞0.05，見表2)。

2.3 PDGF-D及MPO表達(dá)的聯(lián)合分析結(jié)果 根據(jù)PDGF-D及MPO在大腸癌組織中的表達(dá)，經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，PDGF-D及MPO在大腸癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.27，P ＜0.05，見表3)。

3 討論

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，PDGF家族有4個(gè)成員:PDGF-A、B、C、D[3]。PDGF-D 對腫瘤的血管形成具有促進(jìn)作用[4]，腫瘤新生血管的形成在惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，血管形成的過程受到各種因子的調(diào)節(jié)。PDGF-D在多種腫瘤中呈現(xiàn)過表達(dá)，如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、黑色素瘤等。大多數(shù)細(xì)胞因子通過PDGF-D受體的介導(dǎo)，進(jìn)而激活靶細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而發(fā)揮其功能與作用。近期研究表明，PDGF-D與多種腫瘤的血管形成有關(guān)，并在多種腫瘤中都有表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)。

MPO是中性粒細(xì)胞中嗜天青顆粒經(jīng)氧化反應(yīng)后所產(chǎn)生的一種極其重要的過氧化物酶，其主要存在于嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中。MPO氧化作用的過度表達(dá)被認(rèn)為與組織損傷和疾病的起始、進(jìn)展相關(guān)。比如，起源于慢性炎癥的癌癥。同時(shí)MPO氧化活性被認(rèn)為促進(jìn)了化學(xué)致癌物質(zhì)代謝，導(dǎo)致了DNA損傷和修復(fù)過程[5]。Jaganjac等[6]研究表明 MPO 在腫瘤微環(huán)境的表達(dá)是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移后伴隨著丙烯醛而出現(xiàn)的，并在腫瘤細(xì)胞衰退期間表達(dá)增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)MPO可產(chǎn)生自由基，可有效防止自然殺傷細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的對抗反應(yīng)，同時(shí)導(dǎo)致受損DNA堆積，這也可能是間接地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展的原因之一[7]。

表2 PDGF-D和MPO在大腸癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab2 The relationship of the expression of PDGF-D and MPO with clinical pathological parameters in the colorectal cancer tissues

表3 PDGF-D和MPO在大腸癌中表達(dá)的相關(guān)性Tab3 The correlation between expression of PDGF-D and MPO in colorectal cancer tissues

本研究發(fā)現(xiàn)，與大腸腺瘤組織比較，MPO主要表達(dá)于大腸癌的胞漿中;PDGF-D也主要表達(dá)于大腸癌的胞漿中，在胞膜及胞核中也存在著不同程度表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)PDGF-D可以激活下游的NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子的上調(diào)，從而促進(jìn)腫瘤血管的形成，并且使腫瘤周圍的基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)升高[8]，為腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造必要的條件。據(jù)此推測，PDGF-D的高表達(dá)可能與大腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Spearman相關(guān)性分析提示，大腸癌中MPO與PDGF-D呈顯著正相關(guān)。國內(nèi)外的研究認(rèn)為MPO是存在于單核巨嗜細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中的Ⅰ相代謝酶，可代謝激活多種環(huán)境致癌物，如多環(huán)芳烴類、亞硝基化合物、雜環(huán)芳香胺類等，引起DNA損傷而啟動(dòng)細(xì)胞癌變[5]。MPO通過增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平及消耗細(xì)胞內(nèi)能量物質(zhì)來誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，而PDGFD對腫瘤的血管形成具有促進(jìn)作用，因此，兩者共同作用能夠促進(jìn)大腸癌的發(fā)生、發(fā)展，聯(lián)合檢測PDGF-D及MPO在腫瘤患者體內(nèi)的表達(dá)，將有助于評(píng)估惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，評(píng)估手術(shù)患者治療預(yù)后，有可能成為腫瘤細(xì)胞浸潤及轉(zhuǎn)移能力的重要臨床生化評(píng)估指標(biāo)之一。

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