羅昭遜 莫 非 楊國(guó)珍 張 姝 張 然 孫朝琴 袁 竺

貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550004

幽門(mén)螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）是一種單極、多鞭毛、末端鈍圓的革蘭陰性螺桿菌，為胃部常見(jiàn)致病菌，其致病性與毒力性均很強(qiáng)。目前研究認(rèn)為，Hp感染是慢性活動(dòng)性胃炎和消化性潰瘍的主要病因，與胃癌、MALT淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，全世界超過(guò)50%的人有Hp感染，Hp感染在我國(guó)分布廣泛，感染率為40%～90%，多數(shù)地區(qū)為50%左右，平均感染率為59%[1]。Hp的根除有助于潰瘍愈合，可降低胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)性，延緩MALT淋巴瘤的進(jìn)程，因此，Hp感染的治療一直是胃腸病領(lǐng)域的研究焦點(diǎn)之一。Hp根除治療一般采用聯(lián)合用藥，即質(zhì)子泵抑制劑PPI或鉍劑，聯(lián)合應(yīng)用2種抗生素。但隨著抗生素的廣泛應(yīng)用和Hp根除治療的普遍開(kāi)展，Hp對(duì)常用抗生素的耐藥率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。目前治療Hp常用的抗生素包括硝基咪唑類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、青霉素類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)以及喹諾酮、硝基呋喃、利福霉素類(lèi)，并且各地所報(bào)道的各藥物耐藥率存在較大差異。為了初步了解Hp的感染情況及對(duì)甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、四環(huán)素的耐藥情況，本實(shí)驗(yàn)對(duì)收集的580例胃黏膜標(biāo)本進(jìn)行Hp培養(yǎng)，并對(duì)Hp臨床分離株進(jìn)行上述5種抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株來(lái)源 Hp臨床菌株均分離自2012年1月～2013年1月貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化科就診并經(jīng)病理診斷為胃潰瘍、胃炎患者共580例，利用胃鏡活檢鉗采集患者胃竇部黏膜，進(jìn)行Hp培養(yǎng)，菌株經(jīng)尿素酶實(shí)驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)和Hp快速診斷實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定。Hp菌株ATCC700392、ATCC700824購(gòu)買(mǎi)于ATCC。由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心保存。

1.1.2 主要試劑 幽門(mén)螺桿菌快速尿素酶試紙（杭州天和微生物試劑有限公司）；甲硝唑、左氧氟沙星、克拉霉素、阿莫西林、四環(huán)素E-test試紙條（瑞典ABBiodisk公司），萬(wàn)古霉素（批號(hào)為：V2002，純度 98%，規(guī)格 100mg，美國(guó) Sigma）；兩性霉素（批號(hào)為：A9528，純度 98%，規(guī)格 100 mg，美國(guó) Sigma）；多粘霉素（批號(hào)為：S0414，純度 98%，規(guī)格 25 mg，美國(guó) Sigma）；TMP（批號(hào)為：T7883，純度98%，規(guī)格1 g，美國(guó)Sigma），哥倫比亞瓊脂（英國(guó)OXOID公司）；脫纖維羊血（廣州蕊特生物科技有限公司）；

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)和鑒定 取行電子胃鏡檢查患者的胃竇部胃黏膜組織標(biāo)本，放入裝有預(yù)冷腦心浸液無(wú)菌離心管中，經(jīng)研磨后利用Hp快速尿素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，陽(yáng)性者接種于哥倫比亞瓊脂血平板37℃微需氧袋培養(yǎng)72～96 h后，經(jīng)革蘭染色鏡檢和過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)鑒定為Hp后，進(jìn)行增菌及傳代培養(yǎng)[2-3]。

1.3.2 藥敏試驗(yàn) 將臨床株Hp用無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯配制成109cfu/mL濃度的懸液，均勻涂布于含有10%脫脂羊血哥倫比亞血瓊脂平板，待干后貼上E-test試紙條（甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素；左氧氟沙星、四環(huán)素），孵育2 d后觀察Hp對(duì)甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星和四環(huán)素的抑菌情況，抑菌環(huán)和試條交界處的刻度即為最低抑菌濃度值（MIC）。甲硝唑＞32 μg/mL；阿莫西林＞8 μg/mL；克拉霉素＞2 μg/mL；左氧氟沙星＞2 μg/mL；四環(huán)素 2 μg/mL 判定為耐藥[4-5]。

2 結(jié)果

2.1 Hp的培養(yǎng)結(jié)果

580例患者中Hp感染陽(yáng)性為334例，檢出率為57.6%，其中經(jīng)分離培養(yǎng)得到的313株為無(wú)色透明，針尖樣細(xì)小，表面光滑濕潤(rùn)的Hp典型的菌落形態(tài)，經(jīng)革蘭染色鏡檢呈陰性，菌體細(xì)長(zhǎng)彎曲呈螺形，S型或海鷗型，過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、氧化酶實(shí)驗(yàn)及尿素酶實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性，Hp培養(yǎng)陽(yáng)性率為54.0%（313/580）。另外21例胃黏膜標(biāo)本雖鑒定為培養(yǎng)Hp陽(yáng)性，但有其他細(xì)菌污染，未能分離出Hp單個(gè)菌落，未能做藥敏實(shí)驗(yàn)。

2.2 Hp對(duì)5種抗生素的藥敏結(jié)果

Hp對(duì)甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、四環(huán)素的耐藥率分別為 87.2%，25.5%，8.5%，46.8%，23.4%。見(jiàn)表1。

表1 313株Hp對(duì)5種抗生素的耐藥情況[n（%）]

3 討論

自20世紀(jì)80年代國(guó)外學(xué)者從胃黏膜活檢組織中分離出Hp以來(lái)，大量研究證實(shí)Hp不但是人慢性活動(dòng)性胃炎及胃-十二指腸潰瘍的主要致病因素，而且與MALT淋巴瘤和胃癌的發(fā)生也密切相關(guān)，1994年被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IRAC/WHO）明確為Ⅰ類(lèi)人胃癌致癌原。因此根除Hp是預(yù)防Hp相關(guān)性疾病的主要措施。Hp的流行情況常隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展?fàn)顩r、居住條件、飲食衛(wèi)生等社會(huì)因素而變化，一般而言，經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的地區(qū)感染率往往低于發(fā)展中國(guó)家。本研究對(duì)580例患者胃鏡檢查胃黏膜標(biāo)本進(jìn)行Hp培養(yǎng)，其陽(yáng)性率為54.0%，與張玲霞等[6]報(bào)道Hp培養(yǎng)陽(yáng)性率（52%）相近。胃黏膜標(biāo)本培養(yǎng)Hp陽(yáng)性檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于血清學(xué)調(diào)查的檢出率，可能是由于血清學(xué)方法因其抗體水平受到一些因素的影響，如感染后抗體水平陽(yáng)性可持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，而Hp的培養(yǎng)還與標(biāo)本取材部位、培養(yǎng)條件等有關(guān)。

目前臨床多采用質(zhì)子泵抑制劑（PPI）聯(lián)合2種抗生素的三聯(lián)療法為一線根除Hp方案，常用抗生素包括阿莫西林、甲硝唑和克拉霉素等，在一線治療失敗后進(jìn)行補(bǔ)救治療中選用四環(huán)素和左氧氟沙星等藥物。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，Hp耐藥率也在逐漸上升，并呈現(xiàn)出地區(qū)差異。

甲硝唑具有高效的殺菌作用，而且其作用不受胃酸的影響，價(jià)格便宜，因此成為治療Hp感染的首選藥物。但是由于甲硝唑的廣泛使用，其耐藥菌株日益增多，耐藥率逐年上升。2005年西安地區(qū)37株Hp對(duì)甲硝唑耐藥率為81.08%[7]。張曉光等[8]對(duì)廣州地區(qū)人群的耐藥情況研究顯示，甲硝唑的耐藥率為51.8%。本研究分離的313株Hp對(duì)甲硝唑的耐藥率高達(dá)為87.2%。當(dāng)甲硝唑耐藥率達(dá)40%時(shí)，Hp的根除率會(huì)顯著下降，提示貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院Hp對(duì)甲硝唑的耐藥率已達(dá)到較高水平而應(yīng)引起臨床的注意。

阿莫西林是一種β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物，阿莫西林可專(zhuān)一性地與細(xì)菌內(nèi)膜上的靶蛋白PBPs（青霉素結(jié)合蛋白）結(jié)合，抑制肽聚糖的合成，從而發(fā)揮殺菌作用。阿莫西林由于殺菌能力強(qiáng)，且與克拉霉素的聯(lián)合應(yīng)用可以降低克拉霉素的耐藥性，因此阿莫西林成為根除Hp治療的良好藥物之一。本組資料顯示，貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院Hp對(duì)阿莫西林的耐藥率高達(dá)25.5%，普遍高于其他地區(qū)?？死顾氐哪退幝矢鞯貓?bào)道不盡相同，北京、上海、廣東對(duì)克拉霉素耐藥率分別15.7%、10%、6.1%[9-11]。本研究克拉霉素的耐藥率為8.5%，與全國(guó)各地情況基本一致，提示貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院在治療Hp感染時(shí)可選用PPsAC（PPI聯(lián)合阿莫西林和克拉霉素三聯(lián)療法）作為治療方案。

左氧氟沙星屬于喹諾酮類(lèi)藥物，具有殺菌作用，通過(guò)抑制DNA旋轉(zhuǎn)酶（一種由gyrA、gyrB分別編碼A、B亞單位的四聚體，具催化DNA負(fù)性超螺旋的作用）而起作用。有研究表明左氧氟沙星有較好的抗Hp作用，耐藥率較低，且對(duì)克拉霉素和甲硝唑耐藥的Hp仍保持抗菌活性，可作為克拉霉素的替代藥物[12]。我國(guó)各地區(qū)Hp左氧氟沙星耐藥情況也有差異，北京為 29.1%[9]，上海為3.8%[10]。在本研究中有147例左氧氟沙星耐藥，耐藥率達(dá)到46.8%，高于其他地區(qū)?？赡苡捎谫F陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院喹諾酮類(lèi)藥物使用較廣泛有關(guān)。

四環(huán)素為廣譜抗生素，20世紀(jì)90年代初美國(guó)學(xué)者使用四環(huán)素、鉍劑、甲硝唑根除Hp，隨后國(guó)外有較多關(guān)于四環(huán)素對(duì)Hp根治療效的研究，并與鉍劑、PPI、甲硝唑組成的四聯(lián)療法作為二線治療方案。四環(huán)素近年來(lái)作為替代藥物用于Hp的根除治療，其耐藥情況較少見(jiàn)到報(bào)道，平均在5%左右[13]。本研究發(fā)現(xiàn)Hp對(duì)四環(huán)素的耐藥率為23.4%，相比其他地區(qū)較為嚴(yán)重。因此，貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院在治療Hp感染前應(yīng)進(jìn)行抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)，做好耐藥性檢測(cè)。

通過(guò)幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)及對(duì)5種抗生素的藥物敏感試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院幽門(mén)螺桿菌對(duì)甲硝唑、阿莫西林、左氧氟沙星、四環(huán)素的耐藥率高于全國(guó)其他地區(qū)，對(duì)克拉霉素有較好的抗菌活性，提示克拉霉素可以成為Hp補(bǔ)救治療的理想藥物之一。對(duì)于治療方案的選擇，應(yīng)以患者情況為依據(jù)，在了解各種治療方察的利弊后加以取舍。有條件的情況下，治療前應(yīng)進(jìn)行抗生素敏感性試驗(yàn)，避免使用Hp耐藥的抗生素[14-16]。重視幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)，定期進(jìn)行耐藥性監(jiān)測(cè)，對(duì)臨床合理選用抗生素，提高根除率，降低復(fù)發(fā)率，減少耐藥菌株的產(chǎn)生有著十分重要的意義。

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