張亞玲，王寶玉，臺蓮梅，左豫虎，鄭雯，鄧本良，靳學慧

（黑龍江八一農墾大學農學院，大慶163319）

稻瘟病是由稻瘟病菌Magnaporthe oryzae B.Couch（無性態(tài)：Pyricularia oryzae Cavara以前為Magnaporthe grisea（Hebert））Barr.引起的，是對水稻產量損失影響最大的一種病害[1-2]。長期實踐表明，控制此病害最經濟環(huán)保的措施是培育和合理利用抗病品種[3]，然而由于稻瘟病菌群體發(fā)生變異而引發(fā)新的致病小種的出現(xiàn)導致了新選育品種的抗性只能維持短期的效應[4]。因此研究稻瘟病菌群體結構能夠更好地了解稻瘟病菌在田間的組成，對于抗病品種的選育和合理使用有一定的理論意義。對于稻瘟病菌種群結構研究人們利用最多的方法是致病性鑒定的方法進行，對稻瘟病菌的群體結構研究起到了重要的作用，但隨著生物技術的發(fā)展生物技術手段已經完全滲入到生物類群體結構研究中。Hamer等[5]從稻瘟病菌中分離得到一組散布中等重復序列的DNA片段，在稻瘟菌基因組中有豐富的多態(tài)性。從此，DNA指紋分析在稻瘟病菌的群體結構分析中得到廣泛應用。Pot2-rep-PCR是基于中等重復序列的一種PCR擴增技術[6]。利用Pot2-rep-PCR技術對我省水稻主產區(qū)的49個稻瘟病菌菌株進行群體遺傳分析，為北方稻區(qū)水稻抗瘟品種的合理使用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

參試的菌株共有49個，其中黑龍江省稻菌株23個，吉林稻瘟病菌菌株26個（表1）。

表1 試驗菌株Table1 Magnaporthe grisea Isolates used in the study and serial number

1.2 病原菌的單孢分離

取稻瘟病穗頸瘟發(fā)病部位于培養(yǎng)皿內保濕培養(yǎng)24 h，當發(fā)病部位產生孢子后在PDA（1 000 mL水，15 g葡萄糖，12 g瓊脂粉）培養(yǎng)基上采用震落的方法使孢子落于平板培養(yǎng)基上，于25℃下培養(yǎng)36 h，長出菌落后在無菌條件下通過顯微鏡調取單菌落。

1.3 菌絲的培養(yǎng)及DNA的制備

將供試菌株活化于米糠培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10 d后，挑取4塊新鮮菌絲塊（0.5×0.5 cm）接種于經高壓滅菌的液體酵母培養(yǎng)基中。然后置于搖床中28℃恒溫，170 rpm振蕩培養(yǎng)2～3 d，待菌絲體生長茂盛且未變黑時，用滅菌的紗布和濾紙真空過濾，再用滅菌蒸餾水抽洗2次，最后用濾紙盡可能地將菌絲中的水吸干，并分裝于1.5mL離心管中，置于-20℃冰箱中冷凍保存。

將研缽洗凈，于120℃干熱滅菌，冷卻備用。取約150 mg的凍干菌絲置于預冷的研缽中，加入液氮，研磨（3～4次）至粉末狀，然后，用DNA抽提試劑盒（E.Z.N.A.〇RFungal DNA Kit，Omega公司，美國）對基因組DNA進行抽提，其提取方法參照試劑合說明書步驟進行。

1.4 Pot2-Rep-PCR擴增

擴增引物序列：Pot2-1 5’-CGGAAGCCCTAAA GCTGTTT-3’Pot2-2 5’-CCCTCATTCGTCAC ACGTTC-3’

由Sangon（上海生工生物工程技術服務有限公司）公司合成。擴增體系及反應過程如下：

擴增所采用25μL體系。滅菌雙純水12.5μL，引物Pot2-1（25 pmol），Pot2-2（25 pmol）各1μL，dNTP（mM）1μL，含水量Mg2+Buffer 2μL，模板1μL，DNA Taq 0.2μL。反應循環(huán)：94℃5min，變性95℃2.5 min；4個循環(huán)的變性94℃1 min，退火62℃1min，延伸65℃10min；26個循環(huán)的變性94℃30 s，退火62℃1min，延伸65℃10min；最后65℃延伸15min。擴增完畢后取12.5μL在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。

1.5 擴增結果檢測

rep-PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.6 數據處理

把電泳照片上的擴增條帶轉換成2進制數據，即有條帶記為“1”，無條帶記為“0”；按Percent disagreement遺傳距離公式計算相似系數；然后用Statistica中的UPGA（Unweightedpair-group average）聚類分析得到反映菌株親緣關系的樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 rep-PCR遺傳譜型分析

用一對引物（Pot2-1/Pot2-2）對49個供試菌株均有較好擴增效果，擴增產物經電泳檢測，可獲得穩(wěn)定、清晰明亮的譜帶。結果顯示所有供試菌株分別擴增到1～16條帶，大小從100 bp到3 kb之間（圖1），特異性譜帶共有16條，沒有發(fā)現(xiàn)49個菌株都共有的保守帶，可見稻瘟病菌群體存在豐富的遺傳多樣性。說明稻瘟菌在DNA水平上具有高度的異質性。利用UPGA聚類分析，所有的菌株遺傳距離在0.20水平上可將供試的菌株劃分為20個遺傳譜，其中第2個譜系為優(yōu)勢譜系，黑龍江省有11個菌株，吉林省有9個菌株；其次是譜系1有黑龍江省1個菌株，吉林3個菌株；其中譜系2是絕對優(yōu)勢系譜，含有的單型數目超過40%；其他19個系譜的單型數都為1～10。

圖1 部分稻瘟病菌菌株PCR電泳圖Fig.1 Partof the rice blast fungus strains PCR electrophoregram

2.2 不同稻區(qū)稻瘟病菌遺傳多樣性

分析結果表明，20個系譜內含有的菌株數差異明顯，第2個譜系是優(yōu)勢譜系，黑龍江省的吉林省的供試菌株以接近于1∶1的組成分布在這個譜系內；第1譜系內有4個菌株，其中有3個是吉林省菌株。從圖2可以看出吉林菌株JMTY130-1菌株與其他菌株明顯不同，在擴增時能擴增出條帶，只能擴出2條，其他菌株擴增4～12條不等。雖然供試菌株數量不多，但在一定程度上顯現(xiàn)出菌株遺傳背景不同。指紋圖譜遺傳相似性聚類分析顯示：地區(qū)間差異極其明顯。以0.20相似性水平劃分遺傳系譜，49個菌株可劃分在20個系譜中（圖2）。根據聚類分析黑龍江省和吉林省參試菌株所占系譜數與參試菌株數的比例來看，參試稻瘟菌株遺傳多樣性程度黑龍江?。ㄏ底V數/菌株數）黑龍江省（7/23=0.304 3）、吉林省（11/26=0.423 0），這個研究結果雖然與采樣數量有關，但也間接反應了黑龍江與吉林兩省稻瘟病菌的遺傳多樣性的程度，從兩個省的菌株在譜系中有交叉存在的現(xiàn)象也說明黑龍江省菌株和吉林菌的遺傳比較相似。譜系3主要以黑龍江省菌株存在，說明譜系3是黑龍江省特有的譜系類型。

圖2 49個供試稻瘟病菌菌株遺傳距離聚類圖Fig.2 Tree diagram derived from gengetic of 49 strains of Pyricularia oryzae Cav

3 討論

人們采用多種方法對稻瘟病菌遺傳多樣性進行研究，如SRAP方法[3]、RAPD方法[4]、RFLP方法[5-6]等，隨著生物技術的發(fā)展，研究人員研究發(fā)現(xiàn)rep-PCR技術是簡單實用的一種研究稻瘟病菌種群多樣性的技術[7-8]，周益軍等[9]利用Pot2-rep-PCR技術對收集自我國14個省水稻產區(qū)的324個稻瘟病菌株進行了DNA指紋分析。稻瘟病菌在DNA水平上的變異比較高，具有很豐富的多態(tài)性，在20%的遺傳距離水平上，170個單型被劃分成20個遺傳系譜。2004年周益軍等[10]對亞洲五國的稻瘟病菌遺傳多樣性進行了研究，將不同地點的稻瘟病菌劃分為不同的譜系。這些研究結果都說明利用Pot2-rep-PCR技術對稻瘟病菌群體組成的研究有應用價值。

稻瘟病菌種群結構差異的原因我多種可能，但主要分為兩大類，一類是氣候條件，另一類是品種及品種的合理使用[11]。作者認為稻瘟病菌的變異受多種因素共同影響，是一個長期進化過程，稻瘟病菌群體結構因年度和地區(qū)變化是很顯著的，稻瘟病菌具有高度的遺傳多樣性和變異性及較強的時空局限性[6]。通過對黑龍江省和吉林省稻瘟病菌種群結構研究結果表明，兩省稻瘟病菌的種群結構存在豐富的多樣性，吉林省遺傳多樣性要強一些，這可能與吉林省地理位置在黑龍江省以南，受氣候條件影響，吉林省可種植的品種要比黑龍江多些，這對稻瘟病菌的種群結構也會產生影響。另外研究所采用的菌株數量有限，不一定能完全說明黑龍江省和吉林省稻瘟病菌遺傳多樣性差異，可能會與田間實際情況有所不同，為進一步分析稻瘟病菌在田間的種群多樣性還需要大量采集代表地區(qū)稻瘟病菌做進一步的研究分析。

Pot2-rep-PCR是基于中等重復序列的一種PCR擴增技術[12]，具有簡單，分辨能力高的優(yōu)點，在DNA指紋分析在稻瘟病菌的群體結構分析中得到廣泛應用，有許多的研究者利用Pot2-rep-PCR對國內外各不同稻區(qū)稻瘟菌株進行了分析，得到了不同的研究結果，由于各自的研究分析方法有所不同，所得結果不能進行比較分析。因此，探索發(fā)現(xiàn)其他可能途徑以對病原菌DNA指紋進行分析是目前病原菌群體結構研究的重點。

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