劉學(xué)軍 劉瑤 梁晶 史璐 楚金普 李蓓蕾

鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙體牙髓病學(xué)教研室，鄭州 450052

唾液過氧化物酶系統(tǒng)（peroxidase system，PS）是唾液中的抗菌成分，主要包括3個組分：過氧化物酶（peroxidase，PO）、過氧化氫（peroxide，H2O2）和底物，底物包括含硫氰酸根離子（thiocyanate，SCN-）、碘離子（iodine，I-）等的化合物。只有當(dāng)3個組分都存在時，PS才具有活性。PO可催化H2O2將含I-、SCN-的底物分別氧化為次碘鹽OI-、次硫氰酸鹽OSCN-[1]。OI-和OSCN-均為強氧化劑，能氧化對巰基敏感的酶，干擾微生物代謝，有效抑制多種細(xì)菌和真菌的生長[2]?？谇籔O主要存在于口腔唾液和齦溝液中，主要由唾液過氧化物酶（salivary peroxidase，SPO）和髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）組成。SPO和MPO不易獲取，至今尚未得到純品。乳過氧化物酶（lactoperoxidase，LPO）存在于乳汁中，因其來源廣泛，容易獲取，結(jié)構(gòu)和功能與SPO非常相似，所以實驗中多以LPO作為SPO的替代物。乳過氧化物酶系統(tǒng)（lactoperoxidase system，LPS）已應(yīng)用于多種口腔保健品中[3]，這些口腔保健品中多以SCN-作為底物，I-的應(yīng)用還較少。雖然I-氧化產(chǎn)物的抑菌效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過SCN-氧化產(chǎn)物，但是唾液中固有的生理濃度的SCN-存在時會顯著抑制LPO-I-的抗菌效應(yīng)[4]，所以LPO-I-系統(tǒng)的抗菌效應(yīng)未能得到有效的開發(fā)和利用。

本研究擬通過增加I-的量來抵消生理濃度SCN-對I-的抑制作用，從而探索有效發(fā)揮I-抗變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）作用的途徑，并進(jìn)一步研究含不同濃度I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系統(tǒng)對S. mutans的黏附、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyltransferase，GTF）活性和水不溶性細(xì)胞外多糖生成等多個致齲毒力因子的影響，為I-在防齲口腔保健中的應(yīng)用和推廣提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株與主要試劑

S. mutans ATCC 25175（血清型C，由四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點實驗室提供）；腦心浸液補充（brain heart infusion-supplemented，BHI-S）瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液（brain heart infusion，BHI）液體培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）；硫氰酸鉀、碘化鉀、30%H2O2（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；LPO（Sigma公司，美國）；二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 溶液Ⅰ的配制

溶液Ⅰ（當(dāng)實驗中底物為I-和SCN-時，pH值為6.5）配方[4]如下：9 mmol·L-1Na2HPO40.651 g，24 mmol·L-1KH2PO40.656 g，1.5 mmol·L-1MgSO40.036 g，67 mmol·L-1Na2SO41.922 g，加蒸餾水溶解稀釋至200 mL，調(diào)節(jié)pH值為6.5，備用。

1.3 細(xì)菌的復(fù)蘇及培養(yǎng)

將S. mutans凍干粉菌株接種于BHI-S瓊脂培養(yǎng)基上于37 ℃及80%N2、10%H2、10%CO2環(huán)境下培養(yǎng)48 h，鑒定為純培養(yǎng)物后，接種于BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，收集細(xì)菌，并用溶液Ⅰ調(diào)整，調(diào)整溶液Ⅰ的菌懸液密度，使其OD600=0.9，備用。

1.4 試劑的配置及分組

實驗中分別配制LPO（5 μg·mL-1），H2O2（終濃度100 μmol·L-1），SCN-（終濃度1 mmol·L-1）和I-（終濃度分別為0、10、100、1 000、10 000 μmol·L-1）。將S. mutans分為6組，分別加入不同的試劑：5個實驗組分別加入不同濃度I-，并設(shè)1個對照組；每組又分為A、B管，A管加H2O2、SCN-和I-，不加LPO；B管加H2O2、SCN-、I-和LPO。

1.5 含I-的LPO-H2O2-SCN-系統(tǒng)對S. mutans生長的影響

將S. mutans分為6組，每組加入0.1 mL菌懸液，2.5 mL SCN-，B管加2.5 mL LPO（A管以2.5 mL溶液Ⅰ代替），2.5 mL I-，2.5 mL H2O2，對照組加10.0 mL溶液Ⅰ。30 min后加10 μL DTT（終濃度為1 mmol·L-1）終止反應(yīng)，進(jìn)行10倍系列稀釋得到3個濃度梯度，將稀釋液體涂布到BHI瓊脂培養(yǎng)皿上，厭氧培養(yǎng)24 h，計數(shù)菌落形成單位（clonal formation unit，CFU），換算成lgCFU·mL-1。

1.6 含I-的LPO-H2O2-SCN-系統(tǒng)對S. mutans黏附作用的影響

取菌液0.3 mL，與含2%蔗糖的BHI液體培養(yǎng)基按體積比1∶10的比例接種S. mutans，各組加入 SCN-0.1 mL，I-0.1 mL，H2O20.1 mL，B管加入LPO 0.1 mL（A管以0.1 mL溶液I代替LPO），對照組加0.4 mL溶液Ⅰ，30 min后加DTT終止反應(yīng)，試管與水平面呈30°，厭氧培養(yǎng)48 h后收集試管壁上黏附的細(xì)菌，置于分光光度計下測量OD600值，計算細(xì)菌的黏附抑制率。黏附抑制率=（對照組OD600-實驗組OD600）/對照組OD600×100%。

1.7 含I-的LPO-H2O2-SCN-系統(tǒng)對S. mutans生成水不溶性細(xì)胞外多糖的影響

試劑加入量同步驟1.6。取菌液0.3 mL，與含2%蔗糖的BHI液體培養(yǎng)基按體積比1∶10的比例接種S.mutans，加入各試劑反應(yīng)30 min后加DTT終止反應(yīng)，厭氧培養(yǎng)24 h后離心收集細(xì)菌，蒸餾水洗滌，再用0.5 mol·L-1NaOH洗滌，收集上清液，用蒽酮法檢測水不溶性細(xì)胞外多糖的質(zhì)量濃度（μg·mL-1）。

1.8 含I-的LPO-H2O2-SCN-系統(tǒng)對S. mutans GTF活性的影響

試劑加入量同步驟1.6。取菌液0.3 mL，與含2%蔗糖的BHI液體培養(yǎng)基按體積比1∶10的比例接種S.mutans，加入各試劑反應(yīng)30 min后加DTT終止反應(yīng)，厭氧培養(yǎng)24 h后離心收集上清液，用鹽析法提取GTF粗酶，蒽酮法測定酶-底物反應(yīng)液中的還原糖量，計算GTF活性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)由SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，采用t檢驗比較相同I-濃度組A、B管間S.mutans數(shù)量是否有差異，各組總體均數(shù)的比較采用單因素方差分析，各組間均數(shù)的兩兩比較采用LSD檢驗，兩變量之間的相關(guān)分析采用Pearson檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 含I-的LPO-H2O2-SCN-系統(tǒng)對S. mutans生長的影響

各組的lgCFU·mL-1見圖1。A管不加LPO，各實驗組與對照組之間lgCFU·mL-1無明顯差異。B管加入LPO，反應(yīng)30 min后，各實驗組lgCFU·mL-1較A管明顯變小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；隨著I-濃度的升高，lgCFU·mL-1逐漸減小，當(dāng)I-≥100 μmol·L-1時，實驗組lgCFU·mL-1明顯地低于對照組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；當(dāng)I-濃度分別為1 000、10 000 μmol·L-1時，實驗組間兩兩比較均有明顯差異（P＜0.05）。

圖1 含I-的LPO-H2O2-SCN-系統(tǒng)對S. mutans生長的影響Fig 1 The effect of LPO-H2O2-SCN- system with I- on the growth of S. mutans

2.2 含I-的LPO-H2O2-SCN-系統(tǒng)對S. mutans黏附作用的影響

A管不加LPO，各實驗組和對照組間OD600值無明顯差異；B管加入LPO反應(yīng)30 min，各實驗組OD600值較A管明顯變小（圖2）。B管各組OD600測量值和黏附抑制率見表1，可見隨著I-濃度的升高，OD600值減小，LPO-H2O2-SCN-抗菌系統(tǒng)對S.mutans的黏附抑制率升高。除10、100 μmol·L-1濃度組外，其他I-濃度組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；且各實驗組與對照組間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。當(dāng)I-≥100 μmol·L-1時，對S.mutans的黏附抑制率達(dá)到50%以上。

圖2 含I-的LPO-H2O2-SCN-系統(tǒng)對S. mutans黏附作用的影響Fig 2 The effect of LPO-H2O2-SCN- system with I- on the adhesion of S. mutans

表1 B管LPO-H2O2-SCN-系統(tǒng)對S. mutans黏附作用的影響Tab 1 The effect of LPO-H2O2-SCN- system on the adhesion of S. mutans in tube B

2.3 含I-的LPO-H2O2-SCN-系統(tǒng)對S. mutans生成水不溶性細(xì)胞外多糖的影響

各組S.mutans生成水不溶性細(xì)胞外多糖的質(zhì)量濃度見圖3。A管中，各實驗組和對照組間水不溶性細(xì)胞外多糖的質(zhì)量濃度無明顯差異（P＞0.05）。B管加入LPO反應(yīng)30 min后，水不溶性細(xì)胞外多糖的質(zhì)量濃度較A管明顯降低，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；隨著I-濃度的升高，水不溶性細(xì)胞外多糖的質(zhì)量濃度隨之減少，當(dāng)I-≥100 μmol·L-1時，水不溶性細(xì)胞外多糖生成量明顯減少，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 含I-的LPO-H2O2-SCN-系統(tǒng)對S. mutans GTF活性的影響

各組S.mutans的GTF活性見圖4。A管中，各實驗組和對照組間S.mutansGTF活性的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。B管加入LPO反應(yīng)30 min后，GTF活性較A管明顯變小，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；且隨著I-濃度的升高，GTF活性降低，除0和10 μmol·L-1外，其余各組GTF活性的總體均數(shù)間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；各實驗組與對照組均數(shù)之間的差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 含I-的LPO-H2O2-SCN-系統(tǒng)對S. mutans生成水不溶性細(xì)胞外多糖的影響Fig 3 The effect of LPO-H2O2-SCN- system with I- on the synthesis of insoluble exopolysaccharides of S. mutans

2.5 GTF酶活性與水不溶性細(xì)胞外多糖含量的Pearson相關(guān)分析

以GTF酶活性為自變量，水不溶性細(xì)胞外多糖的質(zhì)量濃度為因變量，經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，二者之間有明顯的正相關(guān)關(guān)系（r=0.806，P=0.000）。

3 討論

I-為底物時，LPO-H2O2-I-抗菌系統(tǒng)的有效殺菌成分主要為碘及其氧化物、單線態(tài)氧等物質(zhì)[5]。碘和碘氧化物可以與蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈基團結(jié)合導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性沉淀；也能氧化核酸，破壞DNA和rRNA等[6]；另外，碘還可氧化攻擊還原型輔酶Ⅱ進(jìn)而影響細(xì)菌代謝[7]。單線態(tài)氧是高活性氧化基團，可以氧化損傷微生物細(xì)胞膜，氧化攻擊蛋白質(zhì)和酶，也能與DNA分子中的鳥嘌呤反應(yīng)，影響酶的合成，干擾細(xì)菌代謝[8]。由此可見，LPO-H2O2-I-抗菌系統(tǒng)有多種機制可以共同作用導(dǎo)致微生物生長抑制或死亡。

本實驗中，各組均設(shè)置了A、B兩個管，A管不加LPO，底物（I-、SCN-）不能被H2O2氧化為OI-、OSCN-等物質(zhì)，含不同濃度I-的LPO-H2O2-SCN-系統(tǒng)的抗菌效應(yīng)無法發(fā)揮，僅在I-（10、100、1 000、10 000 μmol·L-1）和微量H2O2（100 μmol·L-1）作用下，S. mutans的生長、黏附、產(chǎn)水不溶性細(xì)胞外多糖和GTF活性的抑制作用并不明顯。B管加入LPO反應(yīng)30 min，底物（I-、SCN-）被氧化，含不同濃度I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系統(tǒng)可以顯著抑制S. mutans生長、黏附、產(chǎn)水不溶性細(xì)胞外多糖和GTF活性。這說明，雖然I-有一定的抑菌作用，但是LPS抗菌效應(yīng)的發(fā)揮依賴于氧化性物質(zhì)（碘及其氧化物、單線態(tài)氧等）的生成，同時也說明只有當(dāng)LPO、H2O2和底物（SCN-、I-等）這3個組分同時存在時，LPS才能顯示出強大的抗菌活性[9]。

B管在實驗時間（30 min）內(nèi)，隨著I-濃度的升高，抗菌系統(tǒng)抑制S. mutans生長的能力增強，當(dāng)I-濃度達(dá)到1 000 μmol·L-1時，含雙底物的LPS對S. mutans的抑制作用明顯高于只含SCN-的實驗組，說明隨著I-濃度增加，生理濃度的SCN-對LPO-H2O2-I-的競爭性抑制作用可以被抵消，且當(dāng)I-濃度足夠大時可發(fā)揮顯著的抗菌作用。

黏附實驗中B管結(jié)果顯示，隨著I-濃度的升高，黏附S. mutans的OD600值減小，含不同濃度I-的LPOH2O2-SCN-抗菌系統(tǒng)對S. mutans的黏附抑制率升高，在I-濃度增至100 μmol·L-1時，黏附抑制率超過50%。雖然LPO-H2O2-SCN-抗菌系統(tǒng)和含不同濃度I-的LPOH2O2-SCN-抗菌系統(tǒng)都可有效抑制S. mutans黏附，但隨著I-的加入，抗菌系統(tǒng)抑制S. mutans黏附能力顯著增強。含I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系統(tǒng)的自由基（單線態(tài)氧等）和底物的活性氧化態(tài)（OSCN-/HOSCN和OI-/HOI）可能通過氧化氨基酸殘基、使S. mutans黏附素、GTF和葡聚糖結(jié)合蛋白（glucan-binding protein，GBP）失活而抑制其黏附能力。

于曉霞[10]采用閃爍計數(shù)法測定酶活性，發(fā)現(xiàn)LPO可抑制GTFD的活性。Korpela等[11]的研究結(jié)果表明，LPO-H2O2-SCN-抗菌系統(tǒng)可抑制吸附于羥磷灰石上的GTFC和GTFD活性。本實驗結(jié)果也表明，含I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系統(tǒng)能夠有效抑制GTF的活性和水不溶性細(xì)胞外多糖的生成，且抑制能力隨著I-濃度的升高而增強。經(jīng)Pearson相關(guān)檢驗，GTF活性與水不溶性細(xì)胞外多糖含量之間有明顯的正相關(guān)關(guān)系（r=0.806，P=0.000），含I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系統(tǒng)抑制了GTF酶的活性，則水不溶性細(xì)胞外多糖含量也隨之減少。由此結(jié)果可見，除了強大的抑菌作用，含I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系統(tǒng)防治齲病的另一主要機制可能是抑制GTF活性，進(jìn)一步抑制了S. mutans的黏附能力和降低了水不溶性細(xì)胞外多糖的生成。

綜上所述，只有當(dāng)3個組分（LPO、H2O2和底物）都存在時，LPS才能顯示出強大的抗菌活性；增加I-的濃度，可以抵消生理濃度的SCN-的抑制作用，使含I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系統(tǒng)發(fā)揮顯著的抑制S. mutans生長、黏附、生成水不溶性細(xì)胞外多糖和GTF活性的作用；因此LPO-I--H2O2系統(tǒng)在預(yù)防齲病方面有著比較優(yōu)越的應(yīng)用前景，有望成為一種有效的防齲藥物。

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