曹日丹 侯本祥

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院牙體牙髓科，北京 100050

糞腸球菌是根管治療失敗患牙最常分離出的細(xì)菌之一，被認(rèn)為是導(dǎo)致根管治療后疾病的重要因素。研究[1-3]顯示，80%以上的慢性根尖周炎和持續(xù)性根尖周炎患牙的根尖牙骨質(zhì)表面存在細(xì)菌生物膜。對根尖生物膜的形成及致病機(jī)制的研究[4-6]發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌的生物膜結(jié)構(gòu)可能使細(xì)菌具有更強(qiáng)的致病性，且很難被徹底清除，但具體機(jī)制仍有待深入研究。目前，建立糞腸球菌根管內(nèi)生物膜模型的報道較多[5,7-11]，而對根尖生物膜模型的研究則非常罕見。本研究的目的是建立糞腸球菌根尖生物膜的體外模型，為糞腸球菌在根尖周炎中致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

離體人牙；糞腸球菌（糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 29212，北京口腔醫(yī)學(xué)研究所保藏管理中心），CDC培養(yǎng)基；碘化丙啶（propidium iodide，PI）、刀豆球蛋白A異硫氰酸熒光素（ConA- fl uorescein isothiocyanate，ConA-FITC）熒光染液（Sigma公司，美國）；激光共聚焦培養(yǎng)皿（MatTek公司，美國），生化培養(yǎng)箱，掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、激光共聚焦掃描電子顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）（Leica公司，美國）；Photoshop CS5圖像分析軟件，Leica Q win圖像分析軟件。

1.2 離體牙的選擇及處理

選取因正畸減數(shù)需要而新鮮拔除的人單根管前磨牙24顆，要求根尖發(fā)育完全，根面無齲壞，無根裂或牙根外吸收。剔除根尖1/3過度彎曲的牙齒，清除樣本表面的牙周膜。

1.3 根尖生物膜模型的建立

1.3.1 根尖樣本的制作 將離體牙標(biāo)本截去牙冠并拔髓，用ProTaper鎳鈦系統(tǒng)冠向下方法進(jìn)行根管預(yù)備，預(yù)備至F2后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）溶液5 mL作用3 min，5.25%次氯酸鈉溶液和生理鹽水交替超聲蕩洗5 min，熱牙膠根管充填，充填后拍攝X線片，若恰填則證明根管封閉可靠。截取離體牙7 mm長度的牙根，將其固定于樹脂基底座上，將金屬結(jié)扎絲末端也固定于樹脂基底座上，上方連接于玻璃瓶膠塞內(nèi)，懸吊根尖樣本；將玻璃瓶膠塞中穿入注射針頭，使瓶內(nèi)與厭氧罐中氣壓一致（圖1）；樣本紫外線消毒后置于無菌厭氧血瓊脂CDC液體培養(yǎng)基中37 ℃下厭氧培養(yǎng)2 d，若液體培養(yǎng)基澄清，說明樣本消毒徹底，4 ℃存放備用。

1.3.2 糞腸球菌菌液培養(yǎng) 糞腸球菌解凍復(fù)蘇，于生化培養(yǎng)箱中37 ℃下厭氧培養(yǎng)，然后分離純化，增菌并收集菌膜，置于無菌CDC液體培養(yǎng)基中，調(diào)整菌液密度為1×108CFU·mL-1，備用。細(xì)菌在CDC瓊脂板培養(yǎng)基上生長，形成菌落呈乳脂狀白色者為糞腸球菌菌落。

1.3.3 實驗分組 將24例離體牙根尖樣本隨機(jī)分為8組，即SEM觀察1、2、7 d組和對照組，CLSM觀察1、2、7 d組和對照組，每組3顆。實驗組浸泡于糞腸球菌ATCC 29212菌液中（37 ℃，厭氧環(huán)境），采用連續(xù)培養(yǎng)法，每2 d用新鮮的CDC液體更換菌液，建立根尖生物膜模型。分別于培養(yǎng)1、2、7 d取根尖樣本，置于無菌EP管中，1 mL PBS緩沖液沖洗3次；對照組樣本浸泡于無菌CDC液體培養(yǎng)基中（37 ℃，厭氧環(huán)境）7 d，處理步驟同實驗組。

圖1 糞腸球菌根尖生物膜模型建立裝置Fig 1 Device for Enterococcus faecalis bio fi lm formation

1.4 根尖生物膜形態(tài)學(xué)觀察

1.4.1 SEM觀察 將每組中的3例根尖組織樣本于2%戊二醛溶液中4 ℃固定1 h，然后于梯度乙醇中脫水，臨界點干燥，樣本表面噴金，置于SEM下觀察，每例樣本在SEM下隨機(jī)選取3個視野進(jìn)行觀察，共9個視野。

1.4.2 CLSM觀察 將每組中的3例根尖組織樣本于2%戊二醛溶液中4 ℃固定1 h，-80 ℃冰凍，用50 μmol·mL-1ConA-FITC染色，室溫下染色5 min，然后PBS緩沖液洗滌，15 μmol·L-1PI室溫下染色5 min，標(biāo)本在PBS緩沖液中洗滌，CLSM分別觀察生物膜逐層掃描圖像和疊加圖像。每例樣本在CLSM下隨機(jī)選取3個視野進(jìn)行觀察，共9個視野。在CLSM下，細(xì)菌被PI染成紅色，細(xì)胞外基質(zhì)被ConA-FITC染成綠色。

1.5 圖像分析

使用Photoshop CS5軟件計算放大3 000倍的SEM視野圖像中的生物膜覆蓋率（%），用Leica Q Win軟件計算CLSM樣本表面的生物膜覆蓋面積（μm2）。采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，SEM觀察樣本表面生物膜覆蓋率的差異采用單因素方差分析，組間均數(shù)的比較采用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 SEM觀察不同時間生物膜的形成過程及覆蓋率

2.1.1 不同時間生物膜形成過程的觀察 通過SEM觀察，1 d組樣本表面的大部分區(qū)域未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌附著，可見單層次散在分布的細(xì)菌，細(xì)菌之間無細(xì)胞外基質(zhì)連接（圖2A）；2 d組樣本表面可見細(xì)菌單層散在分布，細(xì)菌之間出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)連接，大部分區(qū)域仍未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌附著（圖2B）；7 d組可見表面有大量細(xì)菌附著，細(xì)菌呈群落分布，形成多層次的空間結(jié)構(gòu)，有大量細(xì)胞外基質(zhì)包繞，并形成親水通道（圖2C）；對照組表面無細(xì)菌及細(xì)胞外基質(zhì)附著（圖2D）。

圖2 不同時間糞腸球菌生物膜的形態(tài) SEMFig 2 Enterococcus faecalis bio fi lm structure in different times SEM

2.1.2 不同時間生物膜覆蓋率的比較 SEM觀察1、2、7 d組的表面生物膜覆蓋率分別為3.16%±2.23%、5.80%±3.27%、17.23%±1.52%，平均9.04%±6.87%；對照組表面無細(xì)菌及細(xì)胞外基質(zhì)附著。隨著培養(yǎng)時間的增加，樣本表面的生物膜覆蓋率也增加。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)分布特征，且方差齊；經(jīng)單因素方差分析，7 d組與1 d組之間、7 d組與2 d組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而1 d組與2 d組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 CLSM觀察不同時間生物膜的形態(tài)和結(jié)構(gòu)

2.2.1 不同時間生物膜的形態(tài)和熒光面積 隨培養(yǎng)時間增加，PI染色的紅色熒光面積增加，ConA-FITC染色的綠色熒光面積從無到有，生物膜熒光總面積增加（表1和圖3）。1 d組樣本表面細(xì)菌散在分布，無細(xì)胞外基質(zhì)（圖3A）；2 d組樣本表面細(xì)菌增多，無細(xì)胞外基質(zhì)（圖3B）；7 d組表面有大量細(xì)菌，部分呈團(tuán)狀分布，周圍有大量細(xì)胞外基質(zhì)包繞（圖3C）；對照組表面無細(xì)菌及細(xì)胞外基質(zhì)（圖3D）。

表1 不同時間根尖生物膜的熒光面積Tab 1 Fluorescent stained area of apical bio fi lm in different times μm2

圖3 不同時間糞腸球菌生物膜的形態(tài) CLSM × 1 400Fig 3 Enterococcus faecalis bio fi lm structure in different times CLSM × 1 400

2.2.2 根尖生物膜逐層掃描觀察 CLSM可以通過對樣本表面進(jìn)行水平逐層掃描，觀察生物膜不同層面的圖像，如生物膜內(nèi)層和外層（圖4）；由于離體牙根尖樣本表面不平整，與激光共聚焦培養(yǎng)皿底存在一定的傾斜角度，在逐層掃描時所看到的層面同時包含了生物膜內(nèi)層和外層。對比7 d組生物膜的內(nèi)層和外層可以看出，生物膜的內(nèi)層有大量細(xì)菌密集存在，并且被細(xì)胞外基質(zhì)包繞；在生物膜的外層細(xì)菌分布相對松散，細(xì)胞外基質(zhì)成分較內(nèi)層少，在生物膜的表面有少量浮游細(xì)菌存在。

糞腸球菌生物膜剖面的CLSM掃描圖見圖5：掃描層面均與熒光投照方向垂直，而觀察圖像的方向與熒光投照方向平行；因為樣本表面與掃描層面存在一定的傾斜角度，掃描層面可以通過生物膜全層，因此從圖5可以清晰地看出生物膜從內(nèi)層到外層的結(jié)構(gòu)。

圖4 CLSM逐層掃描示意圖Fig 4 Diagrammatic section of CLSM scanning

圖5 糞腸球菌生物膜剖面的CLSM掃描圖 CLSM × 1 400Fig 5 CLSM scanning cross-section of Enterococcus faecalis bio fi lm CLSM × 1 400

3 討論

根管治療后疾病[12]是指根管治療后患牙的根尖周病變未愈合或出現(xiàn)新的病變，其臨床表現(xiàn)主要為患牙根管治療后疼痛持續(xù)存在或者根尖周病損經(jīng)久不愈。

根尖生物膜的形成是根管治療后疾病的主要原因?；佳栏腥靖軆?nèi)的細(xì)菌可以穿過根尖孔而進(jìn)入根尖周組織，在根尖周病損內(nèi)的牙根表面上形成細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)。Sunde等[13]采用外科手術(shù)方法取出根管治療后疾病患牙的根尖進(jìn)行SEM觀察，發(fā)現(xiàn)根尖外表面的細(xì)胞外基質(zhì)包繞了大量球菌，從而認(rèn)為根管治療失敗的原因是根外感染。

本實驗以糞腸球菌ATCC 29212為實驗菌株，是因為糞腸球菌是根管治療失敗的感染根管中最常分離出的細(xì)菌。本研究建立的糞腸球菌根尖生物膜的體外模型，具有一定的代表性，在糞腸球菌生物膜的形態(tài)學(xué)研究以及根管治療后疾病的致病機(jī)制研究中，具有重要的意義。

細(xì)菌生物膜是以細(xì)菌為主的微生物形成的生態(tài)群落，由細(xì)菌及細(xì)胞外基質(zhì)組成，易于在惰性表面或壞死組織中生長，對抗生素及機(jī)體免疫反應(yīng)具有抵抗性[4,14]。生物膜內(nèi)細(xì)菌較其浮游狀態(tài)時對抗生素的耐藥性高100～1 000倍，這一特性是感染難以根除的重要原因之一[15]。

在本實驗中觀察到，隨著培養(yǎng)時間的延長，生物膜中細(xì)菌及細(xì)胞外基質(zhì)均明顯增加，生物膜結(jié)構(gòu)更加致密，體外培養(yǎng)7 d可以形成成熟的根尖生物膜結(jié)構(gòu)。本實驗觀察到生物膜形成過程分為以下幾個階段：1）細(xì)菌在樣本表面可逆吸附；2）細(xì)菌不可逆附著，在樣本表面散在分布；3）細(xì)菌快速生長和繁殖，同時產(chǎn)生細(xì)胞外多糖及蛋白，生物膜開始形成；4）大量微生物附著，形成大的團(tuán)簇樣結(jié)構(gòu)，并不斷向外釋放小團(tuán)的細(xì)菌，定植在樣本表面的其他部位。生物膜結(jié)構(gòu)形成并且成熟后，感染范圍持續(xù)擴(kuò)大，感染不易清除[14]。

現(xiàn)有研究中生物膜模型建立方法主要參照以下條件：1）樣本表面介質(zhì)；2）樣本放置方法；3）培養(yǎng)條件。建立生物膜模型主要選擇96孔板和離體牙作為樣本表面。96孔板皿底表面的粗糙度一致，但牙本質(zhì)小管、牙骨質(zhì)等表面結(jié)構(gòu)無法模擬。本實驗選用人離體牙根尖作為樣本，在牙骨質(zhì)表面建立根尖生物膜模型，將離體牙根尖以豎直懸吊的方式置于菌懸液中，使得生物膜形成的樣本表面與重力方向平行，避免細(xì)菌由于重力作用沉降在樣本表面。本研究在生物膜形成的連續(xù)培養(yǎng)過程中，循環(huán)提供營養(yǎng)物質(zhì)，使糞腸球菌生長維持在恒定的溫度和厭氧環(huán)境[16-18]。此模型能較穩(wěn)定地控制生物膜形成的各項參數(shù)，具有良好的可重復(fù)性。

目前，SEM和CLSM是觀察生物膜的主要方法。SEM觀察法是目前應(yīng)用最多的直觀觀察生物膜結(jié)構(gòu)的方法[8,10]。SEM能夠清晰觀察到樣本表面的微細(xì)立體結(jié)構(gòu)，一直是研究生物膜組成及結(jié)構(gòu)的主要方法；但SEM多用于觀察表面結(jié)構(gòu)，對于多層次的生物膜，則難以觀察到生物膜的全層結(jié)構(gòu)，對于成熟并復(fù)雜的生物膜結(jié)構(gòu)，也難以分辨其內(nèi)細(xì)菌和基質(zhì)的構(gòu)成。CLSM是一種高精度顯微鏡系統(tǒng)，在熒光成像基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，利用計算機(jī)進(jìn)行圖像處理，使用紫外光或可見光激發(fā)熒光探針，得到微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像[19-20]。本研究使用兩種熒光染液PI和ConA-FITC分別染生物膜的細(xì)菌和基質(zhì)，觀察生物膜的結(jié)構(gòu)組成，為研究糞腸球菌生物膜在根尖周炎中的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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