韓波等

【摘要】 目的：研究胃動素對大鼠下丘腦PVN神經元細胞電壓依賴性鉀電流的影響。方法：采用急性分離新生Wistar大鼠下丘腦細胞和全細胞膜片鉗技術的方法，觀察胃動素對大鼠下丘腦PVN神經元細胞電壓依賴性鉀電流的影響。結果：胃動素可抑制大鼠下丘腦PVN神經元電壓依賴性鉀電流，使電流由（5.406±0.86）nA降至（3.621±0.78）nA，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。步進電刺激下丘腦神經元，隨著刺激電壓強度的增強，鉀外向電流增加，使電壓-電流曲線（Ⅰ～Ⅴ曲線）右移，但不改變Ⅰ～Ⅴ曲線的形態(tài)。結論：胃動素可通過抑制大鼠下丘腦PVN神經元細胞電壓依賴性鉀電流，發(fā)揮其增強胃腸運動的作用。

【關鍵詞】 胃動素； 下丘腦PVN細胞； 全細胞膜片鉗技術； 電壓依賴性鉀電流

【Abstract】 Objective：To study the influence of motilin on the voltage-dependent K+ current of hypothalamic PVN neurons.Method：Patch clamp experiment：rat hypothalamic PVN neurons cells were acute dissociated and observed the influence of motilin on voltage-dependent K+ current of hypothalamic PVN neurons using whole-cell patch-clamp techniques.Result：Motilin could inhibit the voltage-dependent K+ current of rat hypothalamic PVN neurons.The current was decreased from （5.406±0.86）nA to （3.621±0.78）nA，the difference was statistically significant（P<0.05）.Step electric stimulation of hypothalamic neurons，with stimulus voltage strength increased，outward potassium current increased，and the Ⅰ-Ⅴ curve shifted right，but the form of the Ⅰ-Ⅴ curve was not changed.Conclusion：Motilin can enhance the motility of gastrointestinal through inhibiting the voltage-dependent K+ current of hypothalamic PVN neurons.

【Key words】 Motilin； Hypothalamic PVN neurons； Whole-cell patch clamp； Voltage-dependent K+ current

First-authors address：The Peoples Hospital of Weicheng District in Weifang City，Weifang 261021，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.25.005

眾所周知，下丘腦是一個重要的飲食調節(jié)中樞。下丘腦位于前腦底部，主要有內側區(qū)和外側區(qū)組成，其內存在一個食欲調節(jié)網(wǎng)絡，并受生物節(jié)律的影響[1-3]。下丘腦弓狀核（ARC）、腹內側區(qū)（VMH）、背內側核（DMN）、室旁核（PVN）、視交叉上核（SCN）和外側區(qū)（LHA）等均是“網(wǎng)絡中心”的重要組成部分。其中VMH被稱為飽食中樞，電刺激VMH可抑制攝食，而損毀雙側VMH則導致攝食過量和肥胖[4]。現(xiàn)在普通認為，PVN是中樞神經調節(jié)胃腸運動的重要中樞。有研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦的弓狀核參與胃動素對胃腸運動的調節(jié)，另外在腦脊液中注射胃動素相關肽ghrelin可導致下丘腦PVN、DMN、VMH的c-fos表達增加，同時孤束核（NTS）c-fos的表達也有增加，并通過迷走神經激活下丘腦促食欲神經肽Y介導的生長素受體的激活[5-7]。

胃動素是一種由22種氨基酸組成的腦腸肽，空腹時由小腸上端黏膜合成并呈周期性釋放，具有促進胃排空和增強胃腸運動的作用[8]。許多研究證明，大鼠腦內存在著胃動素免疫反應陽性神經元。胃動素在大鼠腦內的分布和其他神經肽不同，以小腦的胃動素濃度最高。在下丘腦內側基底部和正中隆起具有中等濃度的胃動素分布，提示腦內的胃動素能神經元可能具有神經內分泌作用[9]。臨床已有報道稱，靜脈內給予胃動素能夠加速胃排空的速率和增強胃癌患者消化間期移行性綜合波三期的運動[10]。多項研究表明，胃動素促進胃腸運動主要在PVN通過PVN-延髓（DVC）-迷走神經軸實現(xiàn)[11-12]。但是，胃動素怎樣通過影響下丘腦PVN神經元細胞的通道實現(xiàn)調節(jié)胃腸運動的作用還未有報道。本文運用全細胞膜片鉗技術觀察胃動素對下丘腦PVN神經元細胞電壓依賴性鉀電流的作用，來進一步探討其調節(jié)胃腸運動的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 新生1～3 d的Wistar大鼠7只，由濰坊醫(yī)學院實驗動物中心提供。胃動素（Sigma公司）、胰蛋白酶、蛋白酶（protease E）（solarblo公司），HEPES（sigma公司），其余均為國產分析純。人工腦脊液（ACSF）：NaCl 126 mmol/L，KCl 5 mmol/L，CaCl2 2 mmol/L，MgSO4

2 mmol/L，NaHCO3 5 mmol/L，NaH2PO4 1.5 mmol/L，endprint

Glucose 10 mmol/L（現(xiàn)配）。通95%O2+5%CO2混合氧，調節(jié)pH至7.4。標準細胞外液：NaCl 150 mmol/L，KCl 5 mmol/L，CaCl2 2 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，D-Glucose 10 mmol/L，MaCl2 1 mmol/L，NaOH調節(jié)pH至7.4。電極內液：KCl 140 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，HEPES

10 mmol/L，MaCl2 1 mmol/L，Na2ATP 4 mmol/L，用KOH調節(jié)pH至7.4。

1.2 細胞分離 根據(jù)Paxions-Watson圖譜，運用酶解以及機械法消化大鼠下丘腦PVN神經元細胞。在0～4 ℃的孵育液中孵育后，取出組織，在ACSF中剪成約

1 cm3的組織塊，室溫靜置30 min。在含0.05%胰酶的緩沖液中于32 ℃通氧消化30 min，沖洗兩遍，將組織塊置于含0.05%蛋白酶E的緩沖液中進行二次消化。棄去消化液，放置在含2 mL細胞外液的35 mm的培養(yǎng)皿中，輕輕吹打成細胞懸液，靜置20 min待細胞貼壁后，即可進行膜片鉗記錄。為了阻斷Ca2+和Na+通道，實驗開始前加入CdCl2（200 ?M）和TTX（1.2 ?M）。

1.3 全細胞膜片鉗記錄 玻璃微電極由微電極拉制儀（PP-83，Narishige，Japan）分兩步拉制，尖端直徑為1～2 μm，充灌內液后電極阻抗為2～4 MΩ。運用EPC9膜片鉗放大器（HEKA，Germany）進行全細胞模式的電壓鉗記錄，當電極入液后加負壓破膜，使電極內液與細胞內液相通，形成全細胞記錄模式，待破膜穩(wěn)定后補償慢電容（Cs）以及局部串聯(lián)電阻（Rs），隨即開始進行記錄，刺激頻率為1 KHz，采集頻率為2 KHz。實驗過程中Rs<25 MΩ且電流穩(wěn)定的數(shù)據(jù)被看作有效數(shù)據(jù)。所有實驗均在20～25 ℃室溫下進行。

1.4 給藥方法 采用微量注射器快速給藥（胃動素最終濃度為10-6 mol/L），觀察給藥前后下丘腦PVN神經元細胞電壓依賴性鉀電流的變化和電流-電壓曲線（Ⅰ～Ⅴ曲線）的改變。每次給藥實驗結束后經灌流沖洗1 min再行下次加藥觀察。

1.5 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)結果分析均在HEKA Pulsefit 8.5和Origin 6.0軟件上完成，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃動素對下丘腦PVN神經元細胞電壓依賴性鉀電流峰值的影響 待急性分離的細胞貼壁后，使用ACSF灌流沖洗，洗去未貼壁的細胞，鏡下觀察選取胞膜完整清晰，立體感強的細胞進行操作。在鉗制電壓-80 mV、刺激電壓（Vt）30 mV條件下，記錄給藥前后下丘腦神經元細胞電壓依賴性鉀電流的改變。結果顯示，給予胃動素（終濃度10-6 mol/L）2～3 min后，電刺激下丘腦神經元細胞，鉀外向峰值電流明顯降低，峰值電流由（5.406±0.86）nA降至（3.621±0.78）nA，降低了（24.01±6.39）%（P<0.05），見圖1。

3 討論

當攝入食物時，其食物成分刺激消化道的感官細胞，產生的信號由迷走神經，通過一系列的級聯(lián)反應，傳入抬到腦干孤束核。然后從孤束核將這內臟資訊傳遞到大腦的其他不同部位，發(fā)揮其參與內分泌，植物神經和行為效應的作用。有研究表明，當注入下丘腦或入腦室胃動素會增加胃腸蠕動，提示下丘腦是胃動素作用一個主站點[13]，而且是通過PVN-DVC-迷走神經軸實現(xiàn)。胃動素在食物的消化中起著重要的作用，它在消化間期呈周期性釋放，并可刺激消化道的機械和細胞電運動，并可引起膽汁的分泌[14]。胃動素及其受體分布廣泛，不僅存在于胃腸等外周器官，在中樞神經系統(tǒng)如下丘腦、海馬、丘腦、垂體、松果體等也有廣泛的存在[15]。最近研究發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺癌患者中也發(fā)現(xiàn)了胃動素的表達，并通過血液運輸影響胃腸運動和PNV的調節(jié)功能[16]。以前有研究表明，在大鼠的下丘腦室旁核（PVN）內給予胃動素和胃動內酯后，可加強大鼠的胃運動，還可誘導PNV中立早基因c-fos的表達，這都表明中樞尤其是下丘腦的胃動素參與了胃腸運動的調節(jié)[6]。

鉀通道在人體的各種生理活動中起著非常重要的作用，其主要由電壓依賴性、受體偶聯(lián)性、鈣敏感及ATP敏感性鉀通道組成，而電壓依賴性鉀通道是其家族中的重要成員。電壓依賴性鉀通道主要由快速失活A型通道和毒蕈堿敏感的M通道組成，尤其是快速失活性鉀通道廣泛分布在神經元中，主要功能是產生動作電位，它的開啟受細胞膜電位的控制，從而調節(jié)神經元的放電及其興奮，發(fā)揮其生理特性。電壓依賴性鉀電流在在受到外來刺激后，可產生外向電流，改變細胞的靜息膜電位，影響細胞的基本電節(jié)律及其動作電位。

本研究發(fā)現(xiàn)，胃動素可顯著地抑制大鼠下丘腦PVN神經元細胞的電壓依賴性鉀電流，峰值電流從（5.406±0.86）nA降至（3.621±0.78）nA，Ⅰ-Ⅴ曲線右移，但是形態(tài)無明顯改變。因電壓依賴性鉀電流主要影響動作電位的時程，當鉀電流被抑制時，動作電位的時程可延長，而導致鈣電流內流增加，進而影響神經遞質的釋放。本課題組以前發(fā)現(xiàn)，胃動素受體激動劑紅霉素也可抑制小鼠海馬神經元電壓依賴性鉀電流，此次結果從而驗證了PVN與海馬等調節(jié)胃腸功能的神經中樞有著密切的聯(lián)系，也證實胃動素可在影響中樞神經元細胞靜息電位的基礎上，發(fā)揮其增強胃腸運動的作用。由于Ca2+也可作為信號轉導途徑的第二信使發(fā)揮其生理作用，具體通過哪種轉導途徑，將在以后研究中進行探討。

參考文獻

[1] Kalra S P，Dube M G，Pu S，et al.Interacting appetite-regulating pathways in the hypothalamic regulation of body weight[J].Endocr Rev，1999，20（1）：68-100.endprint

[2] Cuomo R，DAlessandro A，Andreozzi P，et al.Gastrointestinal regulation of food intake：do gut motility，enteric nerves and entero-hormones play together？[J].Minerva Endocrinol，2011，36（4）：281-293.

[3] Konturek P C，Brzozowski T，Konturek S J.Gut clock：implication of circadian rhythms in the gastrointestinal tract[J].J Physiol Pharmacol，2011，62（2）：139-150.

[4] Bray G A，F(xiàn)isler J，York D A.Neuroendocrine control of the development of obesity：understanding gained from studies of experimental animal models[J].Front Neuroendocrinol，1990，11（1）：128-181.

[5] Xu L，Gao S，Guo F，et al.Effect of motilin on gastric distension sensitive neurons in arcuate nucleus and gastric motility in rat[J].Neurogastroenterol Motil，2011，23（3）：265-270.

[6] Lawrence C B，Snape A C，Baudoin F M，et al.Acute central ghrelin and GH secretagogues induce feeding and activate brain appetite centers[J].Endocrinology，2002，143（1）：155-162.

[7] Fujitsuka N，Asakawa A，Amitani H，et al.Ghrelin and gastrointestinal movement[J].Methods Enzymol，2012，514（1）：289-301.

[8] Boivin M，Raymond M，Riberdy L，et al.Plasma motilin variation during the interdigestive and digestive states in man[J].J Gastr Mot，1990，1（2）：240-246.

[9] Jacobowitz D M，ODonohue T L，Chey WY，et al.Mapping of motiln immunoreactive neurons of the rat brain[J].Poptides，1981，2（4）：479-487.

[10] Fujitsuka N，Asakawa A，Amitani H，et al.Ghrelin and gastrointestinal movement[J].Methods Enzymol，2012，514（1）：289-301.

[11] Yan C L，Wang S B，Jiang Z Y.The effect of motilin in PVN of hypothalamus on the gastric motility[J].Chinese Journal of Applied Physiology，2002，18（4）：317-320.

[12]張愛軍，唐明，蔣正堯.大鼠下丘腦外側區(qū)內微量注射胃動素對胃竇運動和迷走背核復合體神經元電活動的影響[J].生理學報，2002，54（5）：417-421.

[13] Tang M，Zhang H Y，Jiang Z Y，et al.Effect of central administration of motilin on the activity of gastric-related neurons in brain stem and gastric motility of rats[J].Journal of Physiology，2000，52（5）：416-420.

[14]章麗金，鄭曉玲，林志輝，等.胃動素與青壯年膽汁反流的關系探討[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2011，8（29）：144-146.

[15] Deortere I，Van Assdhe G，Peeters T L.Distribution and subcellular localization of motilin binding sites in the rabbit brain[J].Brain Res，1997，777（1-2）：103-109.

[16] Guo F，Xu L，Sun X，et al.The paraventricular nucleus modulates thyroidal motilin release and rat gastric motility[J].J Neuroendocrinol，2011，23（9）：767-77.

（收稿日期：2014-02-27） （本文編輯：歐麗）endprint

[2] Cuomo R，DAlessandro A，Andreozzi P，et al.Gastrointestinal regulation of food intake：do gut motility，enteric nerves and entero-hormones play together？[J].Minerva Endocrinol，2011，36（4）：281-293.

[3] Konturek P C，Brzozowski T，Konturek S J.Gut clock：implication of circadian rhythms in the gastrointestinal tract[J].J Physiol Pharmacol，2011，62（2）：139-150.

[4] Bray G A，F(xiàn)isler J，York D A.Neuroendocrine control of the development of obesity：understanding gained from studies of experimental animal models[J].Front Neuroendocrinol，1990，11（1）：128-181.

[5] Xu L，Gao S，Guo F，et al.Effect of motilin on gastric distension sensitive neurons in arcuate nucleus and gastric motility in rat[J].Neurogastroenterol Motil，2011，23（3）：265-270.

[6] Lawrence C B，Snape A C，Baudoin F M，et al.Acute central ghrelin and GH secretagogues induce feeding and activate brain appetite centers[J].Endocrinology，2002，143（1）：155-162.

[7] Fujitsuka N，Asakawa A，Amitani H，et al.Ghrelin and gastrointestinal movement[J].Methods Enzymol，2012，514（1）：289-301.

[8] Boivin M，Raymond M，Riberdy L，et al.Plasma motilin variation during the interdigestive and digestive states in man[J].J Gastr Mot，1990，1（2）：240-246.

[9] Jacobowitz D M，ODonohue T L，Chey WY，et al.Mapping of motiln immunoreactive neurons of the rat brain[J].Poptides，1981，2（4）：479-487.

[10] Fujitsuka N，Asakawa A，Amitani H，et al.Ghrelin and gastrointestinal movement[J].Methods Enzymol，2012，514（1）：289-301.

[11] Yan C L，Wang S B，Jiang Z Y.The effect of motilin in PVN of hypothalamus on the gastric motility[J].Chinese Journal of Applied Physiology，2002，18（4）：317-320.

[12]張愛軍，唐明，蔣正堯.大鼠下丘腦外側區(qū)內微量注射胃動素對胃竇運動和迷走背核復合體神經元電活動的影響[J].生理學報，2002，54（5）：417-421.

[13] Tang M，Zhang H Y，Jiang Z Y，et al.Effect of central administration of motilin on the activity of gastric-related neurons in brain stem and gastric motility of rats[J].Journal of Physiology，2000，52（5）：416-420.

[14]章麗金，鄭曉玲，林志輝，等.胃動素與青壯年膽汁反流的關系探討[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2011，8（29）：144-146.

[15] Deortere I，Van Assdhe G，Peeters T L.Distribution and subcellular localization of motilin binding sites in the rabbit brain[J].Brain Res，1997，777（1-2）：103-109.

[16] Guo F，Xu L，Sun X，et al.The paraventricular nucleus modulates thyroidal motilin release and rat gastric motility[J].J Neuroendocrinol，2011，23（9）：767-77.

（收稿日期：2014-02-27） （本文編輯：歐麗）endprint

[2] Cuomo R，DAlessandro A，Andreozzi P，et al.Gastrointestinal regulation of food intake：do gut motility，enteric nerves and entero-hormones play together？[J].Minerva Endocrinol，2011，36（4）：281-293.

[3] Konturek P C，Brzozowski T，Konturek S J.Gut clock：implication of circadian rhythms in the gastrointestinal tract[J].J Physiol Pharmacol，2011，62（2）：139-150.

[4] Bray G A，F(xiàn)isler J，York D A.Neuroendocrine control of the development of obesity：understanding gained from studies of experimental animal models[J].Front Neuroendocrinol，1990，11（1）：128-181.

[5] Xu L，Gao S，Guo F，et al.Effect of motilin on gastric distension sensitive neurons in arcuate nucleus and gastric motility in rat[J].Neurogastroenterol Motil，2011，23（3）：265-270.

[6] Lawrence C B，Snape A C，Baudoin F M，et al.Acute central ghrelin and GH secretagogues induce feeding and activate brain appetite centers[J].Endocrinology，2002，143（1）：155-162.

[7] Fujitsuka N，Asakawa A，Amitani H，et al.Ghrelin and gastrointestinal movement[J].Methods Enzymol，2012，514（1）：289-301.

[8] Boivin M，Raymond M，Riberdy L，et al.Plasma motilin variation during the interdigestive and digestive states in man[J].J Gastr Mot，1990，1（2）：240-246.

[9] Jacobowitz D M，ODonohue T L，Chey WY，et al.Mapping of motiln immunoreactive neurons of the rat brain[J].Poptides，1981，2（4）：479-487.

[10] Fujitsuka N，Asakawa A，Amitani H，et al.Ghrelin and gastrointestinal movement[J].Methods Enzymol，2012，514（1）：289-301.

[11] Yan C L，Wang S B，Jiang Z Y.The effect of motilin in PVN of hypothalamus on the gastric motility[J].Chinese Journal of Applied Physiology，2002，18（4）：317-320.

[12]張愛軍，唐明，蔣正堯.大鼠下丘腦外側區(qū)內微量注射胃動素對胃竇運動和迷走背核復合體神經元電活動的影響[J].生理學報，2002，54（5）：417-421.

[13] Tang M，Zhang H Y，Jiang Z Y，et al.Effect of central administration of motilin on the activity of gastric-related neurons in brain stem and gastric motility of rats[J].Journal of Physiology，2000，52（5）：416-420.

[14]章麗金，鄭曉玲，林志輝，等.胃動素與青壯年膽汁反流的關系探討[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2011，8（29）：144-146.

[15] Deortere I，Van Assdhe G，Peeters T L.Distribution and subcellular localization of motilin binding sites in the rabbit brain[J].Brain Res，1997，777（1-2）：103-109.

[16] Guo F，Xu L，Sun X，et al.The paraventricular nucleus modulates thyroidal motilin release and rat gastric motility[J].J Neuroendocrinol，2011，23（9）：767-77.

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