阮尚全, 宋秋菊, 何慧蓉, 張 裕, 羅大英, 蘭子平*

（1.內(nèi)江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,四川 內(nèi)江641112；2.內(nèi)江師范學(xué)院 四川省高等學(xué)校果類廢棄物資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川內(nèi)江641112）

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）為無患子科荔枝屬常綠喬木,是熱帶和亞熱帶的特色水果,主要分布于我國廣東、廣西、福建、臺(tái)灣以及四川的合江縣等地區(qū).合江荔枝產(chǎn)量占四川全省的90%以上,2012年產(chǎn)量已達(dá)1 100多萬kg.荔枝殼為荔枝的外果皮,含有如花青素、紅色素、黃酮類、酚酸和多糖類等多種活性成分,具有很高的藥用價(jià)值［1］.黃酮是廣泛存在于植物細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞次生代謝、具有酚羥基的化合物,由于其自身被氧化而具有抗氧化作用,在體內(nèi)和體外都具有較強(qiáng)的抗氧化性,對(duì)人的毒副作用小,因而受到了國內(nèi)外學(xué)者的高度重視［2-3］.纖維素酶能催化破壞細(xì)胞壁,改變細(xì)胞壁的通透作用,利于細(xì)胞內(nèi)含物滲出,同時(shí)其具有專一性,不破壞其他物質(zhì),保持其他物質(zhì)的原生結(jié)構(gòu),因此與傳統(tǒng)提取方法相比,具有無毒、反應(yīng)條件溫和及催化活力可調(diào)控制等優(yōu)勢(shì),在植物成分的提取中得到了廣泛應(yīng)用［4］；超聲波在介質(zhì)中傳播時(shí)產(chǎn)生的空化作用、機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)、化學(xué)效應(yīng),可提高目標(biāo)物從固相轉(zhuǎn)移到液相的傳質(zhì)速率,提高提取產(chǎn)率,同時(shí)不影響大多數(shù)有效成分的生理活性［5-6］.本文將纖維素酶和超聲波的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合,以四川合江縣產(chǎn)的荔枝殼為原料,建立荔枝殼中黃酮提取的新方法,并對(duì)提取物清除羥基自由基和超氧陰離子自由基的能力進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn),對(duì)提高荔枝殼的綜合利用價(jià)值具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 主要儀器 T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)（北京普析）、KQ-400KDB超聲波清洗器（江蘇昆山）、TD-5臺(tái)式低速離心機(jī)（四川蜀科）、DFT-100型中藥粉碎機(jī)（溫嶺）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（重慶銀河）、AE240電子分析天平（梅特勒-托利多）、HH-S2恒溫水浴鍋.

1.1.2 試劑 纖維素酶（11 kU/G）,蘆?。˙R）,三羥甲基氨基甲烷（BR）,亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇、氫氧化鈉等均為分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取工藝流程 荔枝殼清洗→烘干粉碎→溶劑浸泡酶解→超聲提取→分離顯色→測(cè)定.

1.2.2 黃酮的提取與測(cè)定 試驗(yàn)用荔枝殼采自于四川合江縣,材料洗凈低溫烘干、粉碎.準(zhǔn)確稱取一定量荔枝殼粉于提取瓶中,按照一定固液比加入乙醇和纖維素酶酶解,在一定的溫度下超聲提取,離心分離上層清液定容,按照文獻(xiàn)［7］方法測(cè)定吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得到提取液濃度,計(jì)算總黃酮提取率.

1.2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取0.020 0g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶解于體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇中,定容于100 mL容量瓶中,得到0.20 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液.準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)液 0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00 mL 于25 mL 比色管,按文獻(xiàn)［7］方法加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaNO2溶液1.0 mL,6 min后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的硝酸鋁溶液1.0 mL,放置6 min,加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%NaOH溶液10.0 mL,用蒸餾水定容,在511 nm處測(cè)定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取荔枝殼粉1.000 g于100 mL提取瓶中,做以下因素試驗(yàn):固定料液比為1∶30、pH5、0.06%的纖維素酶、50℃酶解 80 min、280 W超聲波提取20 min條件,乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為10%～80%；固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、0.06%的纖維素酶、pH5、50℃酶解80 min、280 W超聲波提取20 min條件,料液比分別為1∶20～1∶80；固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、料液比1∶30、pH5、50℃浸泡80 min、280 W超聲波提取20 min條件,纖維素酶用量分別為0.00%～0.30%；固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、料液比1∶30、0.06%的纖維素酶、pH5、酶解80 min、280 W超聲波提取20 min條件,酶解溫度為30～70℃；固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、料液比1∶30、0.06%的酶用量、pH5、280 W超聲波提取20 min條件,50℃酶解20～80 min；固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、料液比1∶30、0.06%的纖維素酶、50℃酶解80 min、280 W超聲波提取20 min條件,pH值分別為3～7；固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、料液比1∶30、0.06%的纖維素酶、pH5、50℃恒溫酶解80 min、超聲波提取20 min條件,超聲波功率分別為160～400 W.

1.2.5 抗氧化性實(shí)驗(yàn) 對(duì)·OH清除能力采用水楊酸法,參照文獻(xiàn)［8］方法,在反應(yīng)體系中加入荔枝殼提取物,利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH,在反應(yīng)體系中加入水楊酸有效地捕捉·OH產(chǎn)生有色產(chǎn)物,產(chǎn)物在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度.O2-·清除的實(shí)驗(yàn)采用鄰苯三酚自氧化法,參照文獻(xiàn)［9］利用鄰苯三酚在弱堿性條件下自身氧化產(chǎn)生O2-.和有色中間產(chǎn)物,在反應(yīng)體系中加入荔枝殼提取物,O2-·的生成受到抑制,鄰苯三酚自氧化受阻,在420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度.

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:吸光度 A ＝0.0114c-0.0019,c/（μ g/mL）為蘆丁質(zhì)量濃度,復(fù)相關(guān)系數(shù)R2＝0.9993,蘆丁質(zhì)量濃度在8.0～56.0 μ g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,如圖1所示.

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取率的影響 總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而增加,乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)達(dá)到最高,隨后逐漸降低.這是由于黃酮溶解于乙醇,乙醇體積分?jǐn)?shù)增大利于黃酮的溶出,致提取率增大.但過高的乙醇體積分?jǐn)?shù)使體系介質(zhì)發(fā)生的改變可能降低了超聲波功能作用,致使黃酮的提取率降低,如圖2所示.

2.2.2 料液比對(duì)黃酮提取率的影響 總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而增加,料液比為1∶60時(shí)達(dá)到最高,隨后變化不大,如圖3所示.

2.2.3 酶用量對(duì)黃酮提取率的影響 總黃酮提取率隨著酶用量的升高而增加,在酶用量為0.12%時(shí)達(dá)到最高,隨后逐漸降低.原因是纖維素酶破壞原料的細(xì)胞壁,讓黃酮更易擴(kuò)散到溶劑中,以提高提取率；過高的酶量會(huì)使總黃酮的提取率減小,這是由于底物配比對(duì)酶解作用有較大的影響,同時(shí)纖維素酶的加入也會(huì)加大大分子物質(zhì)（如:果膠等）的溶出,對(duì)黃酮產(chǎn)生吸附,致總黃酮得率降低,如圖4所示.

2.2.4 酶解溫度對(duì)黃酮提取率的影響 總黃酮提取率隨溫度的升高而增加,溫度為60℃時(shí)最高,隨后逐漸降低.這是由于溫度越高,對(duì)原料作用越充分,提取率提高；而酶有一個(gè)最適作用溫度,當(dāng)溫度過高時(shí),酶的活性會(huì)降低,黃酮也會(huì)分解,故提取率降低,如圖5所示.

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)酮提取率的影響 總黃酮提取率隨著酶解時(shí)間的增加而增加,酶解時(shí)間為80 min時(shí)提取率最高,然后逐漸降低.原因是提取時(shí)間增長(zhǎng),有利于黃酮的溶出,提取率增大；但過長(zhǎng)的時(shí)間也會(huì)導(dǎo)致黃酮氧化分解,且乙醇也會(huì)揮發(fā),導(dǎo)致黃酮提取率會(huì)降低,如圖6所示.

2.2.6 酶解pH值對(duì)黃酮提取率的影響 總黃酮提取率隨著pH升高而增加,pH＝5時(shí)最大,隨后逐漸降低.是由于纖維素酶的活性受pH影響,在黃酮提取過程中pH值為5時(shí)是纖維素酶的最適酸度,pH值過低和過高時(shí),酶的活性會(huì)逐漸降低,故黃酮提取率會(huì)也會(huì)隨之受到影響,如圖7所示.

2.2.7 超聲波功率對(duì)黃酮提取率的影響 總黃酮提取率隨著超聲波功率的升高而增加,超聲波功率為240 W處達(dá)到最高,隨后逐漸降低.超聲波功率的增大,有利于黃酮的溶出,但能量過高,也會(huì)導(dǎo)致黃酮分解,如圖8所示.

2.3 正交試驗(yàn)及結(jié)果在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,其他因素為最佳的條件下,主要考查乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、酶用量、酶解時(shí)間對(duì)提取率影響進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì).取3個(gè)水平按L9（34）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),以黃酮提取率為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),確定最佳工藝.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1,方差分析見表2.

表1 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 L9（34） orthogonal experimental design and results

由表1和表2可知:乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、酶解時(shí)間、酶用量等因素均對(duì)荔枝殼中總黃酮的提取有影響；由極差R可知,各因素對(duì)黃酮提取率的影響主次順序?yàn)?A＞C＞B＞D；從荔枝殼中提取黃酮的工藝條件最優(yōu)組合為A2B3C3D2,即乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,料液比1∶70,提取時(shí)間為100 min,酶用量為0.12%為最佳提取條件.方差分析知:乙醇體積分?jǐn)?shù)及酶解時(shí)間對(duì)黃酮提取率有影響具有顯著性,料液比及酶用量對(duì)黃酮提取率有影響但不具顯著性.為進(jìn)一步驗(yàn)證正交試驗(yàn)的結(jié)果及重現(xiàn)性,在最優(yōu)條件下進(jìn)行4次平行實(shí)驗(yàn),荔枝殼的黃酮提取率分別為:5.145%、5.177%、5.016%、5.048%,平均提取率為5.10%.

表2 正交試驗(yàn)的方差分析Table 2 The variance analysis of the orthogonal experiment

2.4 抗氧化性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 清除·OH活性 實(shí)驗(yàn)結(jié)果為:提取物在2.9～29 μ g/mL范圍內(nèi),對(duì)·OH 清除率為 19.89% ～66.67%,如圖9所示.

2.4.2 清除O2-·活性 實(shí)驗(yàn)結(jié)果為:提取物在29～116 μ g/mL 范圍內(nèi),對(duì) O2-·清除率為13.41%～50.227%,如圖10所示.

3 結(jié)論

本文采用單因素聯(lián)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),建立以超聲波協(xié)同酶法提取了荔枝殼中的總黃酮方法,并對(duì)提取產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)了清除·OH和O2-·活性測(cè)定,得出提取荔枝殼中黃酮的最佳工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,料液比1∶70,提取時(shí)間為100 min,酶用量為0.12%,荔枝殼中黃酮類物質(zhì)的提取率為5.10%.提取產(chǎn)物對(duì)O2-·和·OH自由基具有較強(qiáng)的清除能力.

本法作為一種天然產(chǎn)物活性成分分離提取的新技術(shù),具有條件溫和、快速的特點(diǎn).將超聲波和纖維素酶的特點(diǎn)綜合利用,對(duì)提取荔枝殼中的黃酮具有一定的適用價(jià)值.荔枝殼中黃酮物質(zhì)的分離純化等問題有待進(jìn)一步探究.

致謝內(nèi)江師范學(xué)院自然科學(xué)基金（12NJZ02）對(duì)本文給予了資助,謹(jǐn)致謝意.

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