李金梅，閆新豪，王克讓，李小六

（1.保定市第一中心醫(yī)院病理科，河北保定 071000；2.河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北省化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071002）

癌癥已成為嚴(yán)重威脅人類生命健康的主要疾病之一.據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全球每年死于癌癥的人數(shù)超過700萬，預(yù)計(jì)2020年將達(dá)到1 750萬.在中國，每年將近有150萬患者死于惡性腫瘤.由于癌癥發(fā)生誘因和機(jī)制的多樣性和復(fù)雜性，目前尚缺乏有效的治療藥物.因此，研究發(fā)現(xiàn)高效低毒的新型抗腫瘤藥物，具有十分重要的意義［1］.

核苷類衍生物是一類重要的抗腫瘤和抗病毒的化合物［2－5］.核苷類衍生物作為偽底物可與核苷酸合成的相關(guān)酶結(jié)合干擾dNTPs庫從而抑制DNA的復(fù)制，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長的目的，起到抗腫瘤的作用［6－7］.目前臨床上應(yīng)用的核苷類衍生物的抗腫瘤和抗病毒的藥物有Zidovudine，F(xiàn)loxuridine，Didanosine，F(xiàn)ludarabine，Clofarabine and Cladribine（圖1）等.通過化學(xué)方法在核苷類衍生物的糖基或堿基部分修飾是發(fā)現(xiàn)新型核苷類抗腫瘤化合物的重要途徑［8－9］，其中雜環(huán)類化合物的引入有效地提高了核苷類化合物的活性［10－11］.Dasgupta等人合成了一系列C－5′羥基被嗎啉、哌啶和四氫吡咯等取代的尿苷和5－甲基尿苷衍生物，可作為潛在的腫瘤誘導(dǎo)的新生血管抑制劑［12］.最近筆者報道了一系列C－5′羥基取代的嘧啶基5－甲基尿苷和肌苷的化合物，部分化合物的抗腫瘤活性好于陽性對照順鉑，尤其是嘧啶基上N，N－二甲氨基取代的5－甲基尿苷和肌苷的化合物，其對A549細(xì)胞的抑制活性的IC50值接近10μmol／L［13］.

圖1 臨床上應(yīng)用的具有抗腫瘤和抗病毒活性的核苷類衍生物Fig.1 Structures of nucleoside anticancer and antiviral drugs

基于以上分析，設(shè)計(jì)合成了一系列嘧啶基上N，N－二甲基、嗎啉基和六氫吡啶基修飾的C－5′羥基取代嘧啶基5－甲基尿苷和肌苷類衍生物（圖2），研究嘧啶基上環(huán)狀氨基的引入對化合物抗腫瘤活性的影響.合成化合物結(jié)構(gòu)經(jīng)NMR和MS的確證.通過MTT法研究了合成化合物對A549和Hela細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性.

圖2 合成的C－5′羥基取代嘧啶基核苷類衍生物的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structures of novel ribonucleosides with C－5'OH replaced by different pyrimidinyl groups

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SGW X－4顯微熔點(diǎn)測定儀，溫度計(jì)未經(jīng)校正；核磁共振譜（1H NMR，13C NMR）：RT－NMR Bruker AVANCE 400MHz（TMS為內(nèi)標(biāo)）；高分辨質(zhì)譜：FTICR－MS（Ionspec 7.0T）；旋光儀：SGW－1型自動旋光儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司.無水溶劑均按照相應(yīng)常規(guī)方法處理；柱層析硅膠及薄層層析硅膠（TLC，GF254）由青島海洋化工廠生產(chǎn).Hela細(xì)胞和A549細(xì)胞（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部惠贈）.

1.2 合成

如Scheme 1所示，分別以嘧啶基修飾的5－甲基尿苷（1）和肌苷（2）衍生物［13］為原料，在微波輔助下與二甲胺、六氫吡啶和嗎啉反應(yīng)，制備了丙叉基保護(hù)的二甲氨基、六氫吡啶基和嗎啉基修飾的嘧啶基5－甲基尿苷和肌苷衍生物，中間體不經(jīng)分離純化，減壓蒸餾除去溶劑及過量的胺類化合物，進(jìn)而在TFA和水的混合體系中室溫下脫除丙叉基得到目標(biāo)化合物3a－c和4a－c.化合物的結(jié)構(gòu)經(jīng)NMR和MS譜等表征.微波促進(jìn)的反應(yīng)可以提高反應(yīng)的產(chǎn)率，縮短反應(yīng)的時間［14－16］.

化合物3a－c的合成：向20mL微波管中加入0.73mmol化合物1，7.3mmol二甲胺、或六氫吡啶、或嗎啉反應(yīng)，1.2mL（7.3mmol）N，N－二異丙基乙胺和3mL二甲苯后，微波輔助下210℃反應(yīng)20min，TLC監(jiān)測原料反應(yīng)完全.反應(yīng)液經(jīng)減壓蒸餾后得到的固體用10mL預(yù)先配好的三氟醋酸水溶液V（三氟醋酸）∶V（水）＝9∶1）溶解，氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫攪拌反應(yīng)30min，TLC監(jiān)測原料反應(yīng)完全；反應(yīng)液濃縮后，用柱層析分離（V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）＝5∶1），得到化合物3a－c.

化合物3a［13］.

化合物4a－c的合成：向20mL微波管中加入0.72mmol化合物2，7.3mmol二甲胺、或六氫吡啶、或嗎啉反應(yīng)，1.2mL（7.3mmol）N，N－二異丙基乙胺和3mL二乙二醇二甲醚后，微波輔助下190℃反應(yīng)20min，TLC監(jiān)測原料反應(yīng)完全.反應(yīng)液經(jīng)減壓蒸餾后得到的固體用10mL預(yù)先配好的三氟醋酸水溶液（V（三氟醋酸）∶V（水）＝9∶1）溶解，氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫攪拌反應(yīng)30min，TLC監(jiān)測原料反應(yīng)完全；反應(yīng)液蒸發(fā)濃縮后，用柱層析分離（V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）＝3∶1），得到化合物4a－c.

化合物4a［13］.

1.3 細(xì)胞毒性

將所合成的化合物溶解在DMSO溶液中，并且在培養(yǎng)基中稀釋到所需濃度.通過MTT法測定對細(xì)胞的毒性.收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，接種在96孔的微量培養(yǎng)板中（每孔104個細(xì)胞），37℃下在含有體積分?jǐn)?shù)5%CO2的保溫箱中孵育24h.化合物加入到每個孔中最終濃度在10－7到10－4mol／L，設(shè)空白對照和以順鉑為陽性對照（齊魯制藥有限公司）.培養(yǎng)基在37℃含有體積分?jǐn)?shù)5%CO2的保溫箱中孵育48h.培養(yǎng)結(jié)束后，將MTT染色劑（Sigma）溶液（20μL，5mg／μL）加入到每一個孔中.培養(yǎng)4h后，用DMSO溶解細(xì)胞中的藍(lán)色結(jié)晶通過酶標(biāo)儀在570nm波長處測量每個孔的光密度（OD）.根據(jù)公式：（1－ODtreated／ODcontrol）×100%計(jì)算生長抑制率，再計(jì)算IC50值.

2 結(jié)果與討論

利用MTT法分別測定了化合物3a－c和4a－c對A549和Hela細(xì)胞的體外抗腫瘤活性，其中以順鉑為陽性對照.如表1所示，含二甲氨基側(cè)鏈的化合物3a和4a對A549細(xì)胞的IC50值分別為10.73和10.99μmol／L，其活性優(yōu)于陽性對照，而對Hela細(xì)胞沒有活性，IC50值大于100μmol／L.對于六氫吡啶基和嗎啉基修飾的核苷類衍生物3b－c和4b－c不管是對A549細(xì)胞還是Hela細(xì)胞都沒有活性，IC50值都大于100μmol／L.實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明嘧啶基上環(huán)狀的氨基的引入對合成的核苷類化合物的活性有明顯的降低作用.

表1 化合物3a－c和4a－c的抗腫瘤活性Tab.1 Cytotoxic activities of 3a－c and 4a－c

3 結(jié)論

通過微波促進(jìn)的一鍋法反應(yīng)合成了系列新型C－5′羥基取代的嘧啶基5－甲基尿苷和肌苷衍生物，化合物結(jié)構(gòu)經(jīng)NMR和HRMS等表征.通過MTT法測試合成化合物對A549和Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒性，含二甲氨基側(cè)鏈的化合物3a和4a對A549細(xì)胞具有較好的抗腫瘤活性，IC50值分別為10.73和10.99μmol／L，其活性優(yōu)于陽性對照.而六氫吡啶基和嗎啉基修飾的核苷類衍生物3b－c和4b－c對A549細(xì)胞和Hela細(xì)胞都沒有活性.實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明嘧啶基上環(huán)狀的氨基的引入對合成的核苷類化合物的活性有明顯的降低作用.

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