陳潔毅+徐銘恩+王玲+嚴(yán)明+郭淼

摘 要：器官智能和便攜保存技術(shù)，是延長器官保存時(shí)間、運(yùn)輸距離和提高移植成功率的關(guān)鍵。本研究，首先研發(fā)了一套帶多參數(shù)實(shí)時(shí)檢測反饋的腎臟仿生脈動灌注保存系統(tǒng)，并基于該系統(tǒng)研究了豬腎在仿生脈動灌注過程中的功能損傷。研究結(jié)果證明：通過嵌入式系統(tǒng)動態(tài)仿真反饋調(diào)控灌注壓和灌注波形，系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)對腎臟的全仿真脈動灌注；多種傳感器可同步監(jiān)測腎臟的生理指標(biāo)；系統(tǒng)集成度高便攜性強(qiáng)。0到24h的灌注流量結(jié)果顯示，待腎臟適應(yīng)低溫情況后，灌注量保持穩(wěn)定，隨著保存延長灌注量緩慢下降。腎皮質(zhì)切片結(jié)果顯示，相對于單純冷藏保存，仿生脈動灌注保存腎臟中的腎小管損傷較輕，結(jié)構(gòu)保存較為完好。研究證明，腎臟實(shí)時(shí)反饋仿生脈動灌注保存，可以有效延長器官保存時(shí)間，從而增加運(yùn)輸距離，對我國構(gòu)建器官捐贈體系具有重要意義。

關(guān)鍵詞：器官移植；器官灌注保存；仿生脈動；腎小管損傷

引言

2012年中國“鼓勵公民逝世后捐獻(xiàn)器官”等法律條例頒布，國家人體器官捐獻(xiàn)體系開始建立，全國范圍內(nèi)的移植器官捐贈、配型、調(diào)配運(yùn)輸工作即將開展。器官智能保存運(yùn)輸是器官跨醫(yī)院、地區(qū)調(diào)配的技術(shù)基礎(chǔ)，我國在智能、仿生、便攜器官保存系統(tǒng)的研究和開發(fā)領(lǐng)域的工作急待展開。此外，隨著醫(yī)療水平的提高和人類平均壽命的延長，器官移植的患者數(shù)量急劇增加，器官供需失衡的問題也越來越嚴(yán)重。缺乏有效的器官保存技術(shù)是造成器官浪費(fèi)，加劇移植器官供需失衡的重要原因之一[1-2]。研究智能、仿生和便攜器官保存系統(tǒng)對提高移植器官質(zhì)量、降低器官浪費(fèi)和建立國家器官捐贈移植體系具有重要意義。

目前技術(shù)條件下待移植器官的保存有效時(shí)限短，離體腎臟保存時(shí)間很難超過24-30h， 肝臟和心臟的有效保存時(shí)間更短，而且保存系統(tǒng)復(fù)雜龐大，對移植器官的運(yùn)輸和大范圍調(diào)配提出很大挑戰(zhàn)。單純冷凍保存和機(jī)械連續(xù)灌流是近三十年來最主要的離體腎臟體外支持方法[3-8]。傳統(tǒng)的冷凍保存方式由于具有方法簡便的優(yōu)點(diǎn)目前仍是臨床供腎保存的主要方法，但是器官在單純冷凍保存模式下的利用率并不高，也無法進(jìn)行有效的生物修飾[4-5]。機(jī)器灌注保存（Continuous Hypothermic Perfusion，CHP）是現(xiàn)有器官體外支持技術(shù)的突破，其具有延長腎臟保存時(shí)間，提高供腎尤其邊緣供腎的利用率，并能顯著降低移植腎功能恢復(fù)延遲（DGF）等技術(shù)優(yōu)勢[6-7]。機(jī)器灌注保存發(fā)揮優(yōu)勢的關(guān)鍵在于如何實(shí)現(xiàn)智能化灌注，并盡量模擬腎臟體內(nèi)生理環(huán)境。

在原有保存技術(shù)的基礎(chǔ)上，文章研制了一套脈動式多參數(shù)監(jiān)測的腎臟低溫灌注保存系統(tǒng)，系統(tǒng)利用蠕動泵來提供灌注壓，配合多種傳感器配合同步監(jiān)測待移植腎臟的生命指標(biāo)，通過嵌入式系統(tǒng)動態(tài)仿真反饋精確調(diào)控灌注壓和灌注波形，實(shí)現(xiàn)對腎臟的全仿真脈動灌注。在該系統(tǒng)上進(jìn)行了離體豬腎的灌注實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果表明相對于傳統(tǒng)的持續(xù)式機(jī)器灌注，全仿真脈動灌注能夠更真實(shí)模擬主動脈壓力波形，最小程度的減少灌注損傷。

1 腎臟低溫灌注保存系統(tǒng)設(shè)計(jì)

1.1 系統(tǒng)總體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

多參數(shù)脈動式腎臟低溫灌注保存系統(tǒng)的總體結(jié)構(gòu)框架如圖1所示。系統(tǒng)主要由儲腎盒、灌注動力單元、灌注通道、參數(shù)監(jiān)測單元、嵌入式控制單元和人機(jī)交互6個(gè)部分構(gòu)成。嵌入式控制單元是整個(gè)系統(tǒng)智能化運(yùn)行的核心，主要由STM32F103系列微處理器和驅(qū)動電路組成，其作用是接受傳感器檢測的參數(shù)和鍵盤輸入，在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理后向執(zhí)行器和顯示器輸出調(diào)節(jié)規(guī)律。參數(shù)監(jiān)測單元主要由溫度傳感器、壓力傳感器，液位傳感器、氣泡探測器、流量傳感器組成，作用是實(shí)時(shí)監(jiān)測器官接受灌注時(shí)的各種生理參數(shù)，并傳送給微處理器以便響應(yīng)和控制。儲腎盒的作用是允許腎臟容易且安全地在用于灌注、存儲、分析、運(yùn)輸該待移植腎臟的設(shè)備之間移動。灌注動力單元提供精確調(diào)控壓力源和脈動波形調(diào)整。通道控制通過控制電磁閥切換不同的灌注回路，用于排除灌注管道內(nèi)的空氣。人機(jī)交互部分的主要功能通過鍵盤鍵入一些參數(shù)，如灌注平均壓力值，以及系統(tǒng)能實(shí)時(shí)通過顯示屏顯示灌注狀態(tài)等。

1.2 灌注模塊設(shè)計(jì)

灌注模塊的原理框圖如圖2所示，該模塊利用直流減速電機(jī)作為動力源驅(qū)動蠕動泵，利用蠕動泵的滾輪連續(xù)壓動膠管將灌注液壓入腎臟。灌注模塊采用雙通道設(shè)計(jì)，通過濾器、氣泡檢測器、氣泡緩沖室、雙路電磁夾管閥的組合同時(shí)實(shí)現(xiàn)灌注液的抽吸、過濾、氧合和去泡功能。灌注有兩種模式：沖洗模式和灌注模式。沖洗模式用于灌注之前排盡管道回路內(nèi)的氣泡。灌注模式在管道內(nèi)無氣泡條件下對腎臟的離體灌注保存。兩種模式可手動和自動切換。預(yù)留加藥口是為了方便待移植腎臟的生物免疫修飾和提取溶液樣本進(jìn)行生化檢查。

圖2 灌注模塊結(jié)構(gòu)原理框圖

1.3 灌注壓與灌注波形的精確調(diào)控

灌注壓與灌注波形的精確調(diào)控是通過反饋控制直流減速電機(jī)來實(shí)現(xiàn)的。電機(jī)采用MOS管驅(qū)動橋驅(qū)動，驅(qū)動橋用PWM波控制，PWM波的占空比即為直流電機(jī)在一個(gè)周期中通電時(shí)間所占的比例。而蠕動泵每轉(zhuǎn)動一個(gè)滾軸，對灌注回路壓入的一個(gè)單位的灌注液。因此，通過控制PWM波的頻率以及占空比可以精確的控制灌注管道內(nèi)的壓力。灌注壓與灌注波形精確調(diào)控的反饋控制過程如圖3所示。在灌注開始前，根據(jù)不同類型的腎臟設(shè)定平均灌注壓力值，該壓力值在嵌入式控制系統(tǒng)內(nèi)自動對應(yīng)一個(gè)灌注壓力波形F（t），直流電機(jī)再根據(jù)該波形匹配一定的轉(zhuǎn)動頻率，同時(shí)灌注管道內(nèi)的壓力傳感器檢測實(shí)際灌注壓力F1（t）反饋給微處理器，修正電機(jī)轉(zhuǎn)動頻率，從而實(shí)現(xiàn)通道內(nèi)的灌注壓和灌注波形的全仿真動態(tài)反饋調(diào)控，對腎臟進(jìn)行全仿真脈動灌注。

圖3 灌注壓與灌注波形的反饋控制原理框圖

2 系統(tǒng)對豬腎的灌注保存實(shí)驗(yàn)

腎臟體內(nèi)的功能為維持水和電解質(zhì)平衡、過濾血液和排出尿液，故而我們統(tǒng)計(jì)腎臟的動脈灌注流量、腎靜脈流出流量和輸尿管分泌的尿液來衡量腎臟在灌注保存期間的功能動態(tài)。腎臟是雙臟器器官，在實(shí)驗(yàn)中，我們同時(shí)摘取豬的左右腎，取左腎進(jìn)行仿生灌注保存，同時(shí)，右腎以單純冷藏的方式保存，作為灌注保存的對照實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)灌流保存豬腎24小時(shí)，統(tǒng)計(jì)其在0h至24h時(shí)間上的灌注的流量變化。在灌注結(jié)束后，取灌注保存腎臟和單純冷藏保存腎臟樣品做成切片后在顯微鏡下觀察結(jié)構(gòu)的區(qū)別。endprint

2.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1.1 取大小相近健康狀況良好家豬，腹腔切除左右腎臟。腎動脈插管，利用6℃灌注溶液沖洗，沖洗壓力為1.0m至1.2m水柱高度。

2.1.2 沖洗后取左腎置于6℃灌流液，灌注保存。灌流液均采用美國Organ Recovery Systems公司的UW液，灌注壓力值設(shè)為30mmHg，灌注保存24小時(shí)。

2.1.3 作為對照實(shí)驗(yàn)，單純冷藏的腎臟的摘除、沖洗的過程與灌注保存時(shí)操作方式一致，只是在沖洗之后不接入仿生脈動灌注保存系統(tǒng)，而是以單純冷藏的方式保存在同樣溫度的灌流液環(huán)境中。

2.1.4 統(tǒng)計(jì)灌注保存的腎臟在0h、1h、2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h時(shí)間上的灌注的流量變化，每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)重復(fù)8次。

2.1.5 灌注后取腎皮質(zhì)樣品，用10%甲醛固定，乙醇梯度脫水后，石蠟包埋HE（蘇木精伊紅）染色，利用Olympus CKX41型顯微鏡下觀察腎皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)變化。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 離體腎臟維持24h過程中灌注流量的動態(tài)變化

灌注過程中，統(tǒng)計(jì)腎動脈灌注流入量，腎靜脈流出量和輸尿管的流量，流量單位均為用每克組織每分鐘的灌注量（ml/（min·g）），通過檢測流量的變化了解灌注過程腎功能動態(tài)變化的基本信息。結(jié)果進(jìn)行方差分析處理，p<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。灌流流量和相對應(yīng)的腎靜脈、輸尿管流量如表1所示。

表1 灌流流量表

圖4 流量折線圖

腎臟的主要功能是過濾血液和排出尿液，因此腎臟動脈灌入流量，腎臟靜脈輸出流量和輸尿管輸出流量變化是反映腎臟功能的重要指標(biāo)，隨著腎臟腎小球，腎小管結(jié)構(gòu)的破壞，會造成灌注量下降。0到24h的灌注流量的結(jié)果顯示如圖4所示，在0到2小時(shí)，灌注量迅速下降；4小時(shí)到24小時(shí)，灌注量成緩慢下降趨勢，但總體上能夠保持平穩(wěn)。造成這種現(xiàn)象的主要原因是因?yàn)椋嘧㈤_始時(shí)腎臟處于低溫適應(yīng)階段，灌注流量快速下降。待腎臟適應(yīng)低溫情況后，灌注量保持穩(wěn)定，隨著灌注保存時(shí)間延長，細(xì)胞損傷逐漸累加，腎臟腎小球，腎小管結(jié)構(gòu)逐漸破壞，造成灌注量成不斷下降的趨勢。

2.2.2 灌注與冷藏的組織切片結(jié)果對比分析

組織切片可以直觀反映腎臟腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)的改變。圖5、圖6分別為灌注保存24小時(shí)的腎皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)顯微圖和單純冷藏保存腎皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)顯微圖。圖中，其中深色小球?yàn)榧?xì)胞核，淺色結(jié)構(gòu)為細(xì)胞質(zhì)，白色為組織的細(xì)胞間隙。血管壁上皮細(xì)胞呈扁平或橢圓形，排列緊密；腎小管上皮細(xì)胞核大，呈圓形，在管腔外排列成環(huán)。RT為腎小管，Lu為腎小管管腔，Ve是血管管腔，CV為毛細(xì)血管，Gl為腎小球，BC為腎小囊，Gap所指血管與腎小管外周間隙。

圖5顯示腎小囊和腎小球結(jié)構(gòu)保存良好，腎小管上皮細(xì)胞的刷狀緣結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，間距小。

圖6為冷凍保存24小時(shí)的腎組織結(jié)構(gòu)圖。腎小管（RT）、腎小管管腔（Lu）受損嚴(yán)重，出現(xiàn)大量脫落的絨毛。管腔與周邊組織間隙增大。

對比圖5、圖6可以看出仿生脈動式灌流保存的腎臟切片中腎小管細(xì)胞排列較為整齊，腎小管結(jié)構(gòu)保存較為完好，而單純冷藏保存的腎臟切片顯示腎小管上皮細(xì)胞間隙之間的體積逐漸增大。故而認(rèn)為仿生脈動保存系統(tǒng)對腎小管結(jié)構(gòu)具有良好的保護(hù)效果。

3 結(jié)束語

器官灌流保存技術(shù)已有幾十年的發(fā)展歷史，傳統(tǒng)的灌流方式及氣動供能方式使得整個(gè)灌流系統(tǒng)體積龐大，操作復(fù)雜，運(yùn)行不夠穩(wěn)定，這些局限性限制了其在臨床上的應(yīng)用。本研究設(shè)計(jì)出一種腎臟仿生脈動灌流保存系統(tǒng)，能夠更真實(shí)模擬主動脈壓力波形，從而最小程度的減少灌注損傷。我們在這套系統(tǒng)的平臺上對豬腎進(jìn)行了仿生灌注保存實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證系統(tǒng)在對腎臟離體保存中具有良好的保存效果，并對腎臟功能的動態(tài)變化進(jìn)行了初步的研究。

2012年中國“鼓勵公民逝世后捐獻(xiàn)器官”等法律條例頒布，國家人體器官捐獻(xiàn)體系開始建立，全國范圍內(nèi)的移植器官捐贈、配型、調(diào)配和移植的工作即將開展。器官保存系統(tǒng)是器官跨醫(yī)院、地區(qū)調(diào)配的技術(shù)基礎(chǔ)。希望由我們設(shè)計(jì)并開發(fā)的這套腎臟仿生脈動灌注保存系統(tǒng)能夠?yàn)閲业囊浦彩聵I(yè)做出應(yīng)有的貢獻(xiàn)，我們也希望越來越多的有志之士能夠參與到腎臟移植的相關(guān)研究上來。

參考文獻(xiàn)

[1]殷勝勇，葛霽光，郭淼，等.長期灌流維持腎臟功能損傷的內(nèi)在機(jī)理研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（工學(xué)版），2006，40（8）：1339-1343.DOI：10.3785/j.issn.1008-973X.2006.08.011.

[2]徐秋萍，陳周聞，殷勝勇，等.離體貓腎人工生命維持系統(tǒng)的建立[J].中國病理生理，2005，21（9）：1870-1872.

[3]徐嘯，馬潞林.供腎的機(jī)器灌注保存及 LifePort腎轉(zhuǎn)運(yùn)器簡介[J].中華器官移植，2009，30（9）：572-573.DOI：10.3760/cma.j.issn.0254-1785.2009.09.019.

[4]王小波，夏全剛，宋曉燕，等.一種新型器官保存裝置的設(shè)計(jì)[J].低溫與超導(dǎo)，2012，40（4）：63-65.DOI：10.3969/j.issn.1001-7100.2012.04.0

15.

[5]郭明曉.器官保存研究進(jìn)展及展望[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2011，24（11）：1216-1221.DOI：10.3969/j.issn.1008-8199.2011.11.025.

[6]趙聞雨，曾力，朱有華等.器官保存技術(shù)新進(jìn)展[J].中華移植（電子版），2011，5（3）：41-44.DOI：10.3877/cma.j.issn.1647-3903.2011.03.012.

[7]J.F.McAnulty. Hypothermic organ preservation by static storage methods： Current status and a view to the future.Cryobiology，60（2010），pp.S13-S19.endprint

2.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1.1 取大小相近健康狀況良好家豬，腹腔切除左右腎臟。腎動脈插管，利用6℃灌注溶液沖洗，沖洗壓力為1.0m至1.2m水柱高度。

2.1.2 沖洗后取左腎置于6℃灌流液，灌注保存。灌流液均采用美國Organ Recovery Systems公司的UW液，灌注壓力值設(shè)為30mmHg，灌注保存24小時(shí)。

2.1.3 作為對照實(shí)驗(yàn)，單純冷藏的腎臟的摘除、沖洗的過程與灌注保存時(shí)操作方式一致，只是在沖洗之后不接入仿生脈動灌注保存系統(tǒng)，而是以單純冷藏的方式保存在同樣溫度的灌流液環(huán)境中。

2.1.4 統(tǒng)計(jì)灌注保存的腎臟在0h、1h、2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h時(shí)間上的灌注的流量變化，每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)重復(fù)8次。

2.1.5 灌注后取腎皮質(zhì)樣品，用10%甲醛固定，乙醇梯度脫水后，石蠟包埋HE（蘇木精伊紅）染色，利用Olympus CKX41型顯微鏡下觀察腎皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)變化。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 離體腎臟維持24h過程中灌注流量的動態(tài)變化

灌注過程中，統(tǒng)計(jì)腎動脈灌注流入量，腎靜脈流出量和輸尿管的流量，流量單位均為用每克組織每分鐘的灌注量（ml/（min·g）），通過檢測流量的變化了解灌注過程腎功能動態(tài)變化的基本信息。結(jié)果進(jìn)行方差分析處理，p<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。灌流流量和相對應(yīng)的腎靜脈、輸尿管流量如表1所示。

表1 灌流流量表

圖4 流量折線圖

腎臟的主要功能是過濾血液和排出尿液，因此腎臟動脈灌入流量，腎臟靜脈輸出流量和輸尿管輸出流量變化是反映腎臟功能的重要指標(biāo)，隨著腎臟腎小球，腎小管結(jié)構(gòu)的破壞，會造成灌注量下降。0到24h的灌注流量的結(jié)果顯示如圖4所示，在0到2小時(shí)，灌注量迅速下降；4小時(shí)到24小時(shí)，灌注量成緩慢下降趨勢，但總體上能夠保持平穩(wěn)。造成這種現(xiàn)象的主要原因是因?yàn)?，灌注開始時(shí)腎臟處于低溫適應(yīng)階段，灌注流量快速下降。待腎臟適應(yīng)低溫情況后，灌注量保持穩(wěn)定，隨著灌注保存時(shí)間延長，細(xì)胞損傷逐漸累加，腎臟腎小球，腎小管結(jié)構(gòu)逐漸破壞，造成灌注量成不斷下降的趨勢。

2.2.2 灌注與冷藏的組織切片結(jié)果對比分析

組織切片可以直觀反映腎臟腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)的改變。圖5、圖6分別為灌注保存24小時(shí)的腎皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)顯微圖和單純冷藏保存腎皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)顯微圖。圖中，其中深色小球?yàn)榧?xì)胞核，淺色結(jié)構(gòu)為細(xì)胞質(zhì)，白色為組織的細(xì)胞間隙。血管壁上皮細(xì)胞呈扁平或橢圓形，排列緊密；腎小管上皮細(xì)胞核大，呈圓形，在管腔外排列成環(huán)。RT為腎小管，Lu為腎小管管腔，Ve是血管管腔，CV為毛細(xì)血管，Gl為腎小球，BC為腎小囊，Gap所指血管與腎小管外周間隙。

圖5顯示腎小囊和腎小球結(jié)構(gòu)保存良好，腎小管上皮細(xì)胞的刷狀緣結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，間距小。

圖6為冷凍保存24小時(shí)的腎組織結(jié)構(gòu)圖。腎小管（RT）、腎小管管腔（Lu）受損嚴(yán)重，出現(xiàn)大量脫落的絨毛。管腔與周邊組織間隙增大。

對比圖5、圖6可以看出仿生脈動式灌流保存的腎臟切片中腎小管細(xì)胞排列較為整齊，腎小管結(jié)構(gòu)保存較為完好，而單純冷藏保存的腎臟切片顯示腎小管上皮細(xì)胞間隙之間的體積逐漸增大。故而認(rèn)為仿生脈動保存系統(tǒng)對腎小管結(jié)構(gòu)具有良好的保護(hù)效果。

3 結(jié)束語

器官灌流保存技術(shù)已有幾十年的發(fā)展歷史，傳統(tǒng)的灌流方式及氣動供能方式使得整個(gè)灌流系統(tǒng)體積龐大，操作復(fù)雜，運(yùn)行不夠穩(wěn)定，這些局限性限制了其在臨床上的應(yīng)用。本研究設(shè)計(jì)出一種腎臟仿生脈動灌流保存系統(tǒng)，能夠更真實(shí)模擬主動脈壓力波形，從而最小程度的減少灌注損傷。我們在這套系統(tǒng)的平臺上對豬腎進(jìn)行了仿生灌注保存實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證系統(tǒng)在對腎臟離體保存中具有良好的保存效果，并對腎臟功能的動態(tài)變化進(jìn)行了初步的研究。

2012年中國“鼓勵公民逝世后捐獻(xiàn)器官”等法律條例頒布，國家人體器官捐獻(xiàn)體系開始建立，全國范圍內(nèi)的移植器官捐贈、配型、調(diào)配和移植的工作即將開展。器官保存系統(tǒng)是器官跨醫(yī)院、地區(qū)調(diào)配的技術(shù)基礎(chǔ)。希望由我們設(shè)計(jì)并開發(fā)的這套腎臟仿生脈動灌注保存系統(tǒng)能夠?yàn)閲业囊浦彩聵I(yè)做出應(yīng)有的貢獻(xiàn)，我們也希望越來越多的有志之士能夠參與到腎臟移植的相關(guān)研究上來。

參考文獻(xiàn)

[1]殷勝勇，葛霽光，郭淼，等.長期灌流維持腎臟功能損傷的內(nèi)在機(jī)理研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（工學(xué)版），2006，40（8）：1339-1343.DOI：10.3785/j.issn.1008-973X.2006.08.011.

[2]徐秋萍，陳周聞，殷勝勇，等.離體貓腎人工生命維持系統(tǒng)的建立[J].中國病理生理，2005，21（9）：1870-1872.

[3]徐嘯，馬潞林.供腎的機(jī)器灌注保存及 LifePort腎轉(zhuǎn)運(yùn)器簡介[J].中華器官移植，2009，30（9）：572-573.DOI：10.3760/cma.j.issn.0254-1785.2009.09.019.

[4]王小波，夏全剛，宋曉燕，等.一種新型器官保存裝置的設(shè)計(jì)[J].低溫與超導(dǎo)，2012，40（4）：63-65.DOI：10.3969/j.issn.1001-7100.2012.04.0

15.

[5]郭明曉.器官保存研究進(jìn)展及展望[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2011，24（11）：1216-1221.DOI：10.3969/j.issn.1008-8199.2011.11.025.

[6]趙聞雨，曾力，朱有華等.器官保存技術(shù)新進(jìn)展[J].中華移植（電子版），2011，5（3）：41-44.DOI：10.3877/cma.j.issn.1647-3903.2011.03.012.

[7]J.F.McAnulty. Hypothermic organ preservation by static storage methods： Current status and a view to the future.Cryobiology，60（2010），pp.S13-S19.endprint

2.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1.1 取大小相近健康狀況良好家豬，腹腔切除左右腎臟。腎動脈插管，利用6℃灌注溶液沖洗，沖洗壓力為1.0m至1.2m水柱高度。

2.1.2 沖洗后取左腎置于6℃灌流液，灌注保存。灌流液均采用美國Organ Recovery Systems公司的UW液，灌注壓力值設(shè)為30mmHg，灌注保存24小時(shí)。

2.1.3 作為對照實(shí)驗(yàn)，單純冷藏的腎臟的摘除、沖洗的過程與灌注保存時(shí)操作方式一致，只是在沖洗之后不接入仿生脈動灌注保存系統(tǒng)，而是以單純冷藏的方式保存在同樣溫度的灌流液環(huán)境中。

2.1.4 統(tǒng)計(jì)灌注保存的腎臟在0h、1h、2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h時(shí)間上的灌注的流量變化，每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)重復(fù)8次。

2.1.5 灌注后取腎皮質(zhì)樣品，用10%甲醛固定，乙醇梯度脫水后，石蠟包埋HE（蘇木精伊紅）染色，利用Olympus CKX41型顯微鏡下觀察腎皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)變化。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 離體腎臟維持24h過程中灌注流量的動態(tài)變化

灌注過程中，統(tǒng)計(jì)腎動脈灌注流入量，腎靜脈流出量和輸尿管的流量，流量單位均為用每克組織每分鐘的灌注量（ml/（min·g）），通過檢測流量的變化了解灌注過程腎功能動態(tài)變化的基本信息。結(jié)果進(jìn)行方差分析處理，p<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。灌流流量和相對應(yīng)的腎靜脈、輸尿管流量如表1所示。

表1 灌流流量表

圖4 流量折線圖

腎臟的主要功能是過濾血液和排出尿液，因此腎臟動脈灌入流量，腎臟靜脈輸出流量和輸尿管輸出流量變化是反映腎臟功能的重要指標(biāo)，隨著腎臟腎小球，腎小管結(jié)構(gòu)的破壞，會造成灌注量下降。0到24h的灌注流量的結(jié)果顯示如圖4所示，在0到2小時(shí)，灌注量迅速下降；4小時(shí)到24小時(shí)，灌注量成緩慢下降趨勢，但總體上能夠保持平穩(wěn)。造成這種現(xiàn)象的主要原因是因?yàn)?，灌注開始時(shí)腎臟處于低溫適應(yīng)階段，灌注流量快速下降。待腎臟適應(yīng)低溫情況后，灌注量保持穩(wěn)定，隨著灌注保存時(shí)間延長，細(xì)胞損傷逐漸累加，腎臟腎小球，腎小管結(jié)構(gòu)逐漸破壞，造成灌注量成不斷下降的趨勢。

2.2.2 灌注與冷藏的組織切片結(jié)果對比分析

組織切片可以直觀反映腎臟腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)的改變。圖5、圖6分別為灌注保存24小時(shí)的腎皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)顯微圖和單純冷藏保存腎皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)顯微圖。圖中，其中深色小球?yàn)榧?xì)胞核，淺色結(jié)構(gòu)為細(xì)胞質(zhì)，白色為組織的細(xì)胞間隙。血管壁上皮細(xì)胞呈扁平或橢圓形，排列緊密；腎小管上皮細(xì)胞核大，呈圓形，在管腔外排列成環(huán)。RT為腎小管，Lu為腎小管管腔，Ve是血管管腔，CV為毛細(xì)血管，Gl為腎小球，BC為腎小囊，Gap所指血管與腎小管外周間隙。

圖5顯示腎小囊和腎小球結(jié)構(gòu)保存良好，腎小管上皮細(xì)胞的刷狀緣結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，間距小。

圖6為冷凍保存24小時(shí)的腎組織結(jié)構(gòu)圖。腎小管（RT）、腎小管管腔（Lu）受損嚴(yán)重，出現(xiàn)大量脫落的絨毛。管腔與周邊組織間隙增大。

對比圖5、圖6可以看出仿生脈動式灌流保存的腎臟切片中腎小管細(xì)胞排列較為整齊，腎小管結(jié)構(gòu)保存較為完好，而單純冷藏保存的腎臟切片顯示腎小管上皮細(xì)胞間隙之間的體積逐漸增大。故而認(rèn)為仿生脈動保存系統(tǒng)對腎小管結(jié)構(gòu)具有良好的保護(hù)效果。

3 結(jié)束語

器官灌流保存技術(shù)已有幾十年的發(fā)展歷史，傳統(tǒng)的灌流方式及氣動供能方式使得整個(gè)灌流系統(tǒng)體積龐大，操作復(fù)雜，運(yùn)行不夠穩(wěn)定，這些局限性限制了其在臨床上的應(yīng)用。本研究設(shè)計(jì)出一種腎臟仿生脈動灌流保存系統(tǒng)，能夠更真實(shí)模擬主動脈壓力波形，從而最小程度的減少灌注損傷。我們在這套系統(tǒng)的平臺上對豬腎進(jìn)行了仿生灌注保存實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證系統(tǒng)在對腎臟離體保存中具有良好的保存效果，并對腎臟功能的動態(tài)變化進(jìn)行了初步的研究。

2012年中國“鼓勵公民逝世后捐獻(xiàn)器官”等法律條例頒布，國家人體器官捐獻(xiàn)體系開始建立，全國范圍內(nèi)的移植器官捐贈、配型、調(diào)配和移植的工作即將開展。器官保存系統(tǒng)是器官跨醫(yī)院、地區(qū)調(diào)配的技術(shù)基礎(chǔ)。希望由我們設(shè)計(jì)并開發(fā)的這套腎臟仿生脈動灌注保存系統(tǒng)能夠?yàn)閲业囊浦彩聵I(yè)做出應(yīng)有的貢獻(xiàn)，我們也希望越來越多的有志之士能夠參與到腎臟移植的相關(guān)研究上來。

參考文獻(xiàn)

[1]殷勝勇，葛霽光，郭淼，等.長期灌流維持腎臟功能損傷的內(nèi)在機(jī)理研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（工學(xué)版），2006，40（8）：1339-1343.DOI：10.3785/j.issn.1008-973X.2006.08.011.

[2]徐秋萍，陳周聞，殷勝勇，等.離體貓腎人工生命維持系統(tǒng)的建立[J].中國病理生理，2005，21（9）：1870-1872.

[3]徐嘯，馬潞林.供腎的機(jī)器灌注保存及 LifePort腎轉(zhuǎn)運(yùn)器簡介[J].中華器官移植，2009，30（9）：572-573.DOI：10.3760/cma.j.issn.0254-1785.2009.09.019.

[4]王小波，夏全剛，宋曉燕，等.一種新型器官保存裝置的設(shè)計(jì)[J].低溫與超導(dǎo)，2012，40（4）：63-65.DOI：10.3969/j.issn.1001-7100.2012.04.0

15.

[5]郭明曉.器官保存研究進(jìn)展及展望[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2011，24（11）：1216-1221.DOI：10.3969/j.issn.1008-8199.2011.11.025.

[6]趙聞雨，曾力，朱有華等.器官保存技術(shù)新進(jìn)展[J].中華移植（電子版），2011，5（3）：41-44.DOI：10.3877/cma.j.issn.1647-3903.2011.03.012.

[7]J.F.McAnulty. Hypothermic organ preservation by static storage methods： Current status and a view to the future.Cryobiology，60（2010），pp.S13-S19.endprint