王 芳，張慶慶，趙森妙，呂文珍，王鳳麟

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華321004）

烏飯樹(shù)（Vaccinium bracteatum Thunb.），又名南燭，為杜鵑花科越橘屬的常綠或落葉灌木，是一種藥食同源植物，主要分布在長(zhǎng)江流域以南山區(qū)地帶，野生資源豐富[1-2]。研究表明，烏飯葉中除含有豐富的糖、維生素、果膠、多酚類物質(zhì)外，還含有大量的微量元素以及氨基酸[3-4]，具有輕身養(yǎng)顏、黑發(fā)明目、延緩衰老、改善血液微循環(huán)、抑菌抗癌、抗氧化等保健作用和藥用價(jià)值[5-8]。

江浙、福建一帶多以烏飯樹(shù)嫩葉浸漬染米制作烏飯，因其為天然物質(zhì)，人們可放心食用。因此，烏飯樹(shù)又是一種不可多得的天然色素提取原料[9]。目前，天然色素的開(kāi)發(fā)利用仍存在許多問(wèn)題，如提取難度大，提取效率不高，以及在加工和保存過(guò)程中不穩(wěn)定，易受環(huán)境pH、溫度、光照、還原劑、氧化劑、食品添加劑和金屬離子等因素的影響[10-11]。因此，通過(guò)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究不同的提取條件（光照、溫度、pH、金屬離子、甜味劑、氧化劑和還原劑）對(duì)烏飯樹(shù)葉片色素穩(wěn)定性的影響，旨在為烏飯葉色素保存和加工等方面提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試材料 供試的新鮮烏飯樹(shù)葉于2013年5月中旬購(gòu)自金華農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，將新鮮烏飯樹(shù)葉自然陰干，粉碎后冷藏備用，試驗(yàn)于2013年下半年進(jìn)行。氫氧化鈉、鹽酸、氯化鉀、氯化鈉、三氯化鋁、亞硫酸鈉、30%H2O2等實(shí)驗(yàn)所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器 UV-1000 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；BT224S 型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；SC-5A 型超級(jí)恒溫槽（寧波海曙億恒儀器有限公司）；DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；RE-52 AAB 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（溫州奧利生物醫(yī)學(xué)儀器廠）；冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；FE20 型pH 計(jì)（梅特勒·托利多儀器有限公司）；智能生化培養(yǎng)箱（寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 烏飯葉色素的溶解性與光譜特性 稱取1.0 g 烏飯葉干粉，分別加入等體積的蒸餾水、0.5%鹽酸-75%乙醇、75%乙醇、0.5%檸檬酸，混勻后于室溫避光浸提1 h，過(guò)濾離心，取上清液用提取溶劑定容至100 mL，在200～800 nm 的波段內(nèi)掃描[12]，確定最大吸收波長(zhǎng)以及最佳提取溶劑。

1.2.2 烏飯葉色素穩(wěn)定性研究 （1）光照對(duì)色素穩(wěn)定性的影響：用蒸餾水將9.0 mL 色素提取液稀釋至180 mL，分別取兩份烏飯葉色素溶液各30.0 mL，并將其分別置于自然光和黑暗條件下，每隔24 h 測(cè)其A312，觀察并記錄變化趨勢(shì)。（2）溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響：取5.0 mL色素提取液用蒸餾水稀釋至100 mL，避光置于不同溫度[室溫（25～30℃）、40℃、60℃、80℃、100℃]的恒溫水浴鍋中加熱處理，每隔2 h 取樣冷卻至室溫測(cè)其A312。（3）pH 對(duì)色素穩(wěn)定性的影響：取9.0 mL 色素提取液分別加入到pH 值為1、3、5、7、9、11、13 的200.0 mL 溶液中（用0.1 mol/L HCl 和0.1 mol/L NaOH 配置），混勻，在室溫下避光放置，每隔24 h 測(cè)其A312，并觀察顏色變化。（4）金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響：分別配制濃度為0.005、0.010、0.050、0.100 mol/L 的 Na+、Ca2+、Fe3+、K+、Cu2+、Mg2+、Al3+、Fe2+金屬離子溶液，吸取各種金屬離子溶液200.0 mL，添加9.0 mL 烏飯葉色素提取液，充分混勻，室溫下避光放置，每隔24 h 測(cè)其A312，并觀察變化趨勢(shì)。（5）氧化劑與還原劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響：分別配制0.01%、0.05%、0.10%、0.20%的H2O2和0.01、0.05、0.10、0.20 mg/mL 的Na2SO3溶液各200 mL，添加9.0 mL 色素提取液中，充分混勻，室溫下避光放置，每隔24 h 測(cè)其A312，觀察變化趨勢(shì)。（6）甜味劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響：分別配制濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的葡萄糖、蔗糖、果糖溶液各200.0 mL，添加9.0 mL 色素提取液中，充分混勻，室溫下避光放置，每隔24 h 測(cè)其A312，觀察變化趨勢(shì)。以上每個(gè)處理均重復(fù)3 次，最終結(jié)果取3 次數(shù)據(jù)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏飯葉色素的溶解性與光譜特性

烏飯葉色素的溶解性試驗(yàn)結(jié)果顯示，烏飯葉色素易溶于水、乙醇等極性溶劑。由圖1 可知，4種溶劑提取得到的烏飯葉色素提取液均在312 nm 處有最大吸收峰，且蒸餾水提取液的A312大于其它溶劑。因此，選擇蒸餾水作為烏飯葉色素的提取溶劑，具體操作：稱取10.0 g烏飯葉干粉，加入500.0 mL 蒸餾水，常溫浸提1.0 h，抽濾，取濾液，即烏飯葉色素提取液，用于色素穩(wěn)定性研究，色素定量波長(zhǎng)為312 nm。

圖1 不同溶劑中的烏飯葉色素掃描吸收光譜

2.2 光照、溫度和pH 對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

由圖2A 可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，光照和避光條件下的色素溶液在312 nm 處的吸光值均有所下降；光照條件下，放置0 和96 h 時(shí)，烏飯葉色素的A312分別為1.176和1.440，兩者無(wú)顯著性差異，這說(shuō)明光照對(duì)色素穩(wěn)定性影響不大。從圖2B 中可以看出，烏飯葉色素對(duì)溫度不敏感，即使在100℃的高溫下保存4 h，其A312為1.497，與保存0 h 時(shí)的吸光度值無(wú)顯著差異，且在處理過(guò)程中，色素溶液的顏色沒(méi)有發(fā)生明顯變化，這表明該色素?zé)岱€(wěn)定性較好，能很好地適應(yīng)加工和儲(chǔ)存過(guò)程中的溫度變化。從圖2C 中可以看出，在不同的pH 值環(huán)境下，烏飯葉色素同樣表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。放置96 h 時(shí)，pH 值為1、7、13 的處理，烏飯葉色素的A312分別為1.227、1.151、1.268，均與放置0 h 的吸光度無(wú)顯著差異，說(shuō)明烏飯葉色素在pH 值1～13 的環(huán)境下均較穩(wěn)定。

圖2 光照、溫度和pH 對(duì)烏飯葉色素穩(wěn)定性的影響

2.3 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

由圖3 可知，在整個(gè)測(cè)定范圍內(nèi)，與對(duì)照組（蒸餾水）相比，K+、Na+、Al3+和Ca2+四種金屬離子的存在對(duì)烏飯葉色素溶液的吸光值并沒(méi)有顯著變化，保存96 h 后，其吸光值均大于對(duì)照組，這說(shuō)明K+、Na+、Al3+和Ca2+四種離子對(duì)烏飯葉色素有一定的保護(hù)作用。而添加Cu2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+的處理，烏飯葉色素溶液均產(chǎn)生明顯黃褐色沉淀，并且表現(xiàn)出離子濃度越高沉淀越多的趨勢(shì)，這說(shuō)明烏飯葉色素對(duì)這四種金屬離子較敏感，加工貯存時(shí)應(yīng)注意避免與其接觸。

圖3 金屬離子對(duì)烏飯葉色素穩(wěn)定性的影響

2.4 氧化劑與還原劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

如圖4A 所示，低濃度的氧化劑（0.01%～0.05%的H2O2）對(duì)烏飯葉色素溶液沒(méi)有明顯的影響，但當(dāng)氧化劑濃度增大到0.10%～0.20%時(shí)，烏飯葉色素溶液的吸光值明顯下降，顯著低于對(duì)照組；經(jīng)0.20%的H2O2溶液處理96 h 后，烏飯葉色素的吸光值比處理0 h 的下降了82.1%，其下降幅度遠(yuǎn)大于對(duì)照組（34.7%）。如圖4B 所示，添加還原劑Na2SO3對(duì)烏飯葉色素溶液的吸光值無(wú)明顯影響，反而表現(xiàn)出一定的護(hù)色效果。這可能與烏飯葉色素中含有豐富的多酚類物質(zhì)有關(guān)[13]。

圖4 氧化劑、還原劑對(duì)烏飯葉色素穩(wěn)定性的影響

2.5 甜味劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

從圖5 中可以看出，相較對(duì)照組，加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的葡萄糖、果糖后，烏飯葉色素溶液的吸光值降幅變小，其穩(wěn)定性有所增強(qiáng)。當(dāng)蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～1.5%時(shí)，色素溶液吸光值下降趨勢(shì)相對(duì)平緩，而蔗糖濃度為2.0%時(shí)，放置96 h 后，烏飯葉色素溶液的吸光值由1.516下降至0.711，降幅較大。由此可知，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，在一定范圍內(nèi)，蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，烏飯葉色素的吸光值越小。這說(shuō)明烏飯葉色素對(duì)高濃度的蔗糖較敏感， 使用時(shí)應(yīng)注意。

圖5 甜味劑對(duì)烏飯葉色素穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論

烏飯葉色素的溶解性與光譜特性試驗(yàn)結(jié)果表明，該色素易溶于水、乙醇等極性溶劑；經(jīng)紫外-可見(jiàn)光譜測(cè)定可知，該色素在312 nm 處有最大吸收峰。烏飯葉色素穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，該色素有良好的光穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，適應(yīng)的pH 使用范圍較廣；K+、Na+、Al3+、Ca2+四種金屬離子對(duì)烏飯葉色素穩(wěn)定性影響不大，還表現(xiàn)出一定的護(hù)色效果，而Fe3+、Mg2+、Cu2+和Fe2+四種金屬離子可使色素沉淀變色，使用時(shí)應(yīng)注意避開(kāi)；Na2SO3和低濃度H2O2與色素共存時(shí)無(wú)不良影響，而高濃度H2O2對(duì)色素影響較大；葡萄糖、果糖和低濃度蔗糖對(duì)烏飯葉色素影響較小，高濃度蔗糖不利于色素保存。

[1]Wang L，Xu H N，Yao H Y.Phenolic composition and scavenging capacity of Vaccinium bracteatum Thunb.Leaves[J].International Journalof Food Properties，2011，14（4）：721-725.

[2]王 立，姚惠源.烏飯樹(shù)樹(shù)葉中黃酮類色素的提取與分離純化[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（9）：120-125.

[3]Maria R R，Ivan I，Maria C B R，et al.Effect of yophilized Vaccinium berriesonmemory，anxietyand locomotion inadultrats[J].Pharmacological Research，2005，52：457-462.

[4]王 立，蔣甜燕，張 暉，等.酶法提取烏飯樹(shù)樹(shù)葉黑色素及其穩(wěn)定性研究[J].食品工業(yè)科技，2008，（10）：224-226，258.

[5]Wang L，Zhang X T，Hai Y.Effect of Vaccinium bracteatum Thunb.Leaves extract on blood glucose and plasma lipid levels in streptozotocin-induced diabeticmice[J].Journal of Ethnopharmacology，2010，130（3）：456-469.

[6]余 清.烏飯葉多酚提取物抗氧化能力初探[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2012，33（3）：10-11，18.

[7]Landa P，Skalove L，Bousova L.In vitro anti-proliferative and anti-inflammatory activity of leaf and fruit extracts from Vaccinium bracteatum Thunb.[J].Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences，2014，27（1）：103-106.

[8]Langhansova L，Landa P，Marsik P.Production of flavonoids from Vaccinium bracteatum Thunb.In bioreactors[J].In Vitro Cellular&DevelopmentalBiology-Animal，2012，48（1）：78-79.

[9]李永祥，詹少華，蔡永萍，等.板栗殼色素的提取、純化及穩(wěn)定性[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2008，24（9）：298-309.

[10]Mahmoud Y，Mohammad B H N，Reza F.Optimisation of ultrasoundassisted extraction of natural pigment from annatto seeds by response surfacemethodology（RSM）[J].Food Chemistry，2014，155：319-324.

[11]廖芙蓉，闞健全.籽粒莧花穗色素的穩(wěn)定性研究[J].食品科學(xué)，2013，34（5）：127-131.

[12]ChenW P，LiP，Wang XH.Chemicalstabilityofyellow pigmentextracted from the flower bud of Sophora japonica L.（Huaimi）[J].International Journalof Food Scienceand Technology，2010，45（8）：1666-1672.

[13]王 立，姚惠源，陶冠軍，等.烏飯樹(shù)樹(shù)葉中黃酮類色素的抗氧化活性[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006，25（4）：81-84，88.