李英英， 邵劉云， 劉 肖， 張秀方， 胡 慧， 王亞賓， 陳麗穎

(河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002)

生鮮豬肉中致病性球菌的雙重PCR檢測方法的建立與應用

李英英， 邵劉云， 劉 肖， 張秀方， 胡 慧， 王亞賓， 陳麗穎

(河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002)

以金黃色葡萄球菌clfa基因和溶血性鏈球菌sdy基因為靶基因設計引物.通過對單個基因PCR和多重基因 PCR擴增進行特異性、敏感性試驗以及優(yōu)化反應體系，建立了快速檢測溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌的雙重PCR方法.在鄭州市不同地區(qū)隨機抽檢126份生鮮豬肉樣品，分別進行了雙重PCR檢測和常規(guī)微生物學檢驗.結果表明，建立的雙重PCR方法特異性好，抗干擾能力強，靈敏度可達到102ng·L-1.在126個樣品中檢測出溶血性鏈球菌的樣品數(shù)為7份，檢出率為5.55%；檢出金黃色葡萄球菌陽性的樣品數(shù)為8份，檢出率為 6.35%.

金黃色葡萄球菌；溶血性鏈球菌；豬肉；雙重PCR；檢測

近年來，隨著經(jīng)濟全球化進程加快，食品安全已經(jīng)成為當今世界性公共衛(wèi)生熱點.引起食源性疾病的首要因素是食源性致病菌，其多數(shù)暴發(fā)案例是通過致病性細菌污染食品而引起的[1].其中，溶血性鏈球菌(Streptococcushemolyticus)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是2種重要的致病性球菌，且以金黃色葡萄球菌對肉與肉制品的污染最為嚴重[2].豬肉作為中國消費量最大的肉類食品，也是溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌污染的高危畜產(chǎn)品，因此對其進行致病性球菌檢測具有重要的食品衛(wèi)生學意義.目前，對肉類食品中致病菌的檢測主要使用以核酸和蛋白質為核心的技術，如PCR以及衍生技術[3]、生物芯片[4]、酶聯(lián)免疫技術[5]、ATP熒光技術[6]等，這些技術和傳統(tǒng)技術相比具有很多技術上的優(yōu)勢，但同時其強操作性、大成本、高費用、多設備等問題，使得這些方法在實際生產(chǎn)中并不能大批量的推廣，并且由于大多檢測菌種單一，技術優(yōu)勢很難惠及生鮮豬肉的工業(yè)化生產(chǎn)中，使得目前在一線生產(chǎn)中缺少實用且同時能檢測多種致病菌的方法.在生鮮豬肉的實際生產(chǎn)中，不同的加工程序均可能受到致病菌的污染，要確保食品安全必須對生鮮豬肉的最終產(chǎn)品進行殘存菌的檢測.目前一種基于引物DNA序列特異性的多重 PCR 技術能夠在同一反應體系中快速、準確同時檢測多種病原菌，具有很高的應用前景[7].本研究以溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌的特異性基因sdy，clfa為研究對象，在確定方法特異性和抗干擾能力的基礎上，用優(yōu)化后的反應體系建立了一種快速、靈敏且特異性強的雙重PCR方法，實現(xiàn)了對豬肉中這2種致病菌的同時檢測.

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株及肉樣 金黃色葡萄球菌(Staphyloccusaureus)ATCC25923、溶血性鏈球菌(Streptococcushemolytics)ATCC21059、產(chǎn)氣莢膜桿菌(Bacilusperfringens)13124F0、蠟樣芽胞桿菌(BacilusCereus)11778F0、單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)19114F0、大腸桿菌(E.coli)、沙門氏菌(Salmonella) 14028F1以及志賀氏菌(Shigella) 12022F1 等標準菌株均由河南農(nóng)業(yè)大學動物微生物學與免疫學實驗室保存.126個待檢生鮮豬肉樣品先后采集自鄭州市區(qū)6家綜合性超市、8家冷鮮肉專賣店和5個農(nóng)貿市場的生鮮豬肉銷售點，每個抽樣點抽取樣本數(shù)不少于5個.

1.1.2 試劑 PCR反應試劑：DL2000 DNA Ladder Marker,Taq PCR Master Mix 均購自上海生工生物工程有限公司；腦心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基(BHI)購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；1×TAE電泳緩沖液、瓊脂糖、GoldView、無水乙醇、異丙醇、Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒由上海生工生物工程有限公司提供；核酸回收試劑盒TaKara 購自寶生物工程(大連)有限公司.

1.1.3 儀器 sp-D垂直凈化工作臺；Eppendorf 離心機；DYCP-31B型電泳槽；DYY-111-6B型電泳儀；PTC-200型PCR儀；AlphalmagerTM2200型凝膠圖像分析系統(tǒng)；恒溫培養(yǎng)箱；榮華SHA-C水浴恒溫振蕩器；CF長風數(shù)顯調節(jié)水浴鍋，北京市長風儀器公司生產(chǎn)；ZF型紫外透射反射分析儀；78-1型磁力加熱攪拌器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司生產(chǎn)；LX-100手掌型離心機，江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠生產(chǎn)；MVS-1旋渦混合器，北京北德科學器材有限公司生產(chǎn).

1.2方法

1.2.1 PCR引物設計與合成 根據(jù)GenBank收錄的金黃色葡萄球菌clfa基因和溶血性鏈球菌sdy基因，應用軟件Premier 5.0設計2對引物，其目的擴增片段長度分別為635，309 bp(表1).引物由上海生工生物工程有限公司合成.

1.2.2 樣品處理與細菌基因組DNA的提取 將保存的菌種復蘇后在BHI營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)16 h.挑取典型單個菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，參照Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明[8]，分別進行各參考菌株基因組DNA的提取，并以相同方法制備待檢肉樣菌液混合DNA模板.

樣品處理參照食品安全國家標準(GB 4789.10—2010)，處理方法如下：稱取25 g 樣品至盛有 225 mL 7.5 %氯化鈉肉湯的無菌均質杯內，8 000～10 000 r·min-1均質1～2 min.然后將處理的樣品接種于BHI液體培養(yǎng)基中參照Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明提取樣品DNA.

表1 PCR引物序列與目的基因長度Table 1 Double PCR amplification of the target gene sequence

1.2.3 單基因PCR特異性試驗 金黃色葡萄球菌clfa基因擴增的反應體系為：模板DNA 2 μL，PCR buffer 2.5 μL，MgCl2( 3 mmol·L-1)1.5 μL，dNTP(400 μmol·L-1) 2 μL，上、下游引物(20 μmol·L-1，)各1 μL，其余用去離子水補足至25 μL.擴增條件：94 ℃預變性5 min，PCR循環(huán)為94 ℃變性 45 s，(50，52，54 ℃)退火 40 s，72 ℃ 延伸40 s，34個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min.溶血性鏈球菌sdy基因擴增的反應體系同金黃色葡萄球菌clfa基因的擴增體系.擴增條件：94 ℃預變性5 min，PCR循環(huán)為94 ℃變性45 s，(49，50，51，52，53，54 ℃)退火 40 s，72 ℃ 延伸40 s，34個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min.將擴增的目的基因送至上海生工進行測序.

1.2.4 單基因PCR敏感性試驗 分別測定金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌的DNA模板濃度，稀釋成相同質量濃度105ng·L-1后10倍遞增稀釋10-3～105ng·L-1，按1.2.2所述方法提取DNA，進行PCR擴增，測定單重PCR的敏感性.

1.2.5 雙重PCR檢測與反應條件優(yōu)化 以金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌混合DNA為模板，對引物、酶等因素進行摸索.根據(jù)退火溫度比引物Tm低3～5 ℃的原則，選取52，53，54，55，56 ℃等5個溫度，在梯度PCR儀上進行最佳退火溫度的優(yōu)化.

1.2.6 雙重PCR體系的特異性試驗 采用已經(jīng)建立的雙重PCR體系對金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、蠟樣芽胞桿菌、單增李斯特菌、大腸桿菌、沙門氏菌及志賀氏菌的混合DNA和去離子水進行雙重PCR擴增，以檢測引物和反應的特異性.

1.2.7 雙重PCR體系的敏感性試驗 把金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌基因組DNA模板混合，按1.2.5方法進行雙重PCR擴增，測定雙重PCR擴增的敏感性.

1.2.8 生鮮豬肉中致病性球菌的雙重PCR檢測與分析 從鄭州多家綜合型超市、冷鮮肉專賣店及農(nóng)貿市場等不同地方采集新鮮豬肉樣品，分別營養(yǎng)肉湯中增菌培養(yǎng)，提取細菌基因組DNA并進行PCR檢測.

2 結果與分析

2.1單基因PCR特異性和核苷酸序列分析

經(jīng)PCR檢測，針對溶血性鏈球菌標準菌株sdy基因擴增出大小約為309 bp 的特異性片段，而對金黃色葡萄球菌clfa基因的PCR產(chǎn)物大小約為635 bp.上述PCR產(chǎn)物經(jīng)測序分析，與GenBank中公布的基因序列同源性均達到99%以上，說明所擴增條帶就是預期的目的基因片段.試驗表明，上述2對引物在50～54 ℃之間都能擴增出特異性目的片段，這為雙重PCR方法的建立奠定了基礎(圖1、圖2).敏感性分析表明，對溶血性鏈球菌靈敏度達到10 ng·L-1，對金黃色葡萄球菌靈敏度為102ng·L-1.

M.DL2000 DNA Marker;1.50 ℃;2.52 ℃;3.54 ℃;4.陰性對照.

M.DL2000 DNA Marker;1.50 ℃;2.52 ℃;3.54 ℃;4.Negative control.

圖1金黃色葡萄球菌的PCR擴增結果
Fig.1ResultofHemolyticstreptococcusPCRamplification

M.DL2000 DNA Marker;1.49 ℃;2.50 ℃;3.51 ℃;4.52 ℃;5.53 ℃;6.54 ℃;7.陰性對照.

M.DL2000 DNA Marker;1.49 ℃;2.50 ℃;3.51 ℃;4.52 ℃;5.53 ℃;6.54 ℃;7.Negative control.

圖2溶血性鏈球菌的PCR擴增結果
Fig.2ResultofStreptococcushemolyticusPCRamplification

2.2雙重PCR的擴增及條件優(yōu)化

溫度梯度PCR試驗顯示，在52 ℃時引物之間的相互競爭和相互影響最小，擴增效果最佳.因此，該雙重PCR體系的退火溫度選為52 ℃(圖3).

經(jīng)一系列試驗摸索，最終確定雙重PCR最佳反應體系為：Taq PCR Master Mix，12 μL；2種菌的上游引物各1 μL；2種菌的下游引物各1 μL；模板DNA，2 μL；ddH2O，7 μL；總體積25 μL.其反應條件為：94 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共進行34個循環(huán)，最后72 ℃終延伸10 min.

M.DL2000 DNA Marker;1.56 ℃;2.55 ℃;3.54 ℃;4.53 ℃;5.52 ℃;6.陰性對照.

M.DL2000 DNA Marker;1.56 ℃;2.55 ℃;3.54 ℃;4.53 ℃;5.52 ℃;6.Negative control.

圖3退火溫度的優(yōu)化
Fig.3Optimizationoftheannealingtemperature

2.3多重PCR的特異性檢測結果

應用該體系對8個受試菌株的混合DNA模板進行PCR擴增(圖4)，僅在金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌相應基因位置上出現(xiàn)特異性目的條帶，而對其他6種細菌未出現(xiàn)非特異性擴增.

M.DL2000 DNA Marker;1.溶血性鏈球菌；2.金黃色葡萄球菌；3.溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌；4～6.金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、蠟樣芽胞桿菌、單增李斯特桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌混DNA;7.陰性對照.

M.DL2000 DNA Marker;1.Hemolyticstreptococcus;2.Staphylococcusaureus;3.Hemolyticstreptococcus、Staphylococcusaureus;4～6.Staphylococcusaureus,Hemolyticstreptococcus.Clostrdiumperfringens,Bacilluscereus,ListeriaLesterbacillus,Escherichiacoli,Salmonella,Shigellamixed DNA.

圖4雙重PCR特異性檢測結果
Fig.4ResultofthespecifitydetectingbyduplexPCR

2.4雙重PCR的敏感性試驗

在優(yōu)化的PCR反應條件下，該雙重PCR對金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌的檢測靈敏性達到102ng·L-1(圖5).

M.DL2000 DNA Marker;1～8.DNA模板依次10倍稀釋;9.陰性對照.

M.DL2000 DNA Marker;1～8.The DNA template is 10 times of dilution; 9.Negative control.

圖5雙重PCR敏感性檢測
Fig.5SensitivityofduplexPCR

2.5應用雙重PCR檢測肉樣的結果

對126份生鮮豬肉中致病性球菌的雙重PCR檢測結果分別如圖6和表2所示.

M.DL2000 DNA Marker,1～8.樣品；9.陰性對照.

M.DL2000 DNA Marker,1～8.Sample;9.Negative control.

圖68份生鮮豬肉樣品的PCR檢測
Fig.6PCRdetectionof8samplesofrawpork

經(jīng)PCR檢測，126份生鮮豬肉樣品中，金黃色葡萄球菌陽性樣品8份，檢出率為6.35%；溶血性鏈球菌陽性樣品7份，檢出率為5.55%；金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌同時檢出的有3份(2.38%).

3 討論

食品安全與人們的生活息息相關.近些年來，隨著科技的不斷進步，各種單一的食源性致病菌PCR快速檢測方法被大量建立起來，如沙門氏菌[9]、金黃色葡萄球菌[10]、鏈球菌[11]、大腸桿菌O157[12]、單核細胞增生性李斯特氏菌[13]等病原微生物的檢測.但這些方法都只能對食品中單一的致病菌進行檢測，而現(xiàn)實生活中食品往往同時存在多種致病菌，致使食品安全的實際監(jiān)測面臨樣本量大、時間緊急、人員不足等一系列問題.單一的病原微生物PCR的檢測已越來越不能滿足不斷發(fā)展的需求.所以近些年在單重PCR的基礎上建立起的多重PCR技術引起廣泛重視并已有了很大的進展，趙新等[14]根據(jù)沙門氏菌侵襲力蛋白A基因(invA)、單核細胞增生李斯特菌蛋白轉錄調控基因(prfA)、金黃色葡萄球菌自溶素基因(alt)、蠟樣芽孢桿菌的促旋酶B亞單位基因(gyrB)設計引物，進行多重PCR擴增，建立了4種致病菌的多重PCR檢測體系.王娜等[15]根據(jù)副溶血性弧菌的耐熱直接溶血素基因(tdh)、金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因(nuc)和單增李斯特菌的侵入關聯(lián)蛋白基因(iap)分別設計引物，進行PCR擴增及反應條件的優(yōu)化，建立了對3種菌的多重PCR檢測方法.王虎虎等[16]利用3種致病菌的特異性基因invA，HlyA，rfbE 設計 3 對引物，在雞肉生產(chǎn)一線建立起可同時檢測沙門氏菌、單增李斯特菌、大腸桿菌 O157的三重 PCR 方法.金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌同為革蘭氏陽性菌，可通過食品加工人員、炊事員或銷售人員帶菌等途徑造成食品污染，危害人類健康.金黃色葡萄球菌的clfa基因主要編碼菌體中的黏附纖維蛋白原凝集素，是金黃的葡萄球菌的主要抗原蛋白[17]，溶血性鏈球菌的sdy基因是溶血性鏈球菌中相對較保守的基因序列[18].因此，本試驗選取此2種基因作為靶基因，能夠建立起一種快速、靈敏、特異性強的雙重PCR方法，實現(xiàn)對豬肉中金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌的同時檢測.

表2 生鮮豬肉中溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌雙重PCR檢測結果Table 2 Detection of raw pork of hemolytic streptococcus PCR

多重PCR的擴增對反應條件要求嚴格，如果不嚴格控制則容易出現(xiàn)非特異性擴增從而導致最終擴增失敗[19].其中，退火溫度是影響PCR特異性的重要因素，溫度過高將影響模板和引物的結合而使擴增效率降低，過低則會導致非特異擴增[20].本研究先分別進行了兩種模板的單重PCR退火溫度摸索，尋找出盡量一致的退火溫度，然后再將模板混合，進行雙重PCR體系的退火溫度優(yōu)化，結果顯示退火溫度為52 ℃時能達到最佳效果，且穩(wěn)定性良好.優(yōu)化的雙重PCR體系檢測金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌DNA的敏感性為102ng·L-1.檢測結果表明，所建立的雙重PCR檢測方法能同時監(jiān)測兩種致病性球菌，特異性好，靈敏度高，能滿足對市場生鮮豬肉快速檢測和監(jiān)控的需要.

檢測結果顯示，在126份生鮮豬肉樣品中，金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌的陽性檢出分別為6.35%和5.55%，二者同時被檢出的占2.38%.而索玉娟等[21]對生牛乳、生鮮肉(豬肉、牛肉、羊肉、雞肉) 、肉制品、水產(chǎn)品、速凍食品、果蔬、豆制品等510份樣品檢測表明，金黃色葡萄球菌陽性食品108 份，總檢出率為21.2%，其中生豬肉中檢出率18%.這反映出當前市售生鮮豬肉中金黃色葡萄球菌的污染情況較以往幾年有所降低，這可能與近些年國家食品安全部門對肉類食品行業(yè)的嚴格規(guī)范有關，但這種菌引發(fā)的污染還在一定程度上存在著，仍需引起重視.究其原因，可能與動物生前的健康狀況與體表衛(wèi)生清潔程度、屠宰加工操作規(guī)范及屠宰用水衛(wèi)生狀況以及鮮肉保藏、運輸、銷售等環(huán)節(jié)的交叉污染等因素有關.本研究中來自超市和農(nóng)貿市場的樣品陽性檢出率相對較高，可能是由于這些地點人口流動大、冷鏈保障不到位、售賣人員操作不當?shù)仍斐傻?需要引起注意的是，樣品中存在的死亡致病菌雖然對食肉安全影響不大，但在實際檢測過程中，由于PCR的靈敏性極高，可能擴增出其DNA，而造成假陽性現(xiàn)象.因此可先利用多重PCR方法對樣品進行初篩，然后再結合國標法驗證，從而提高檢測的準確率[22,23].

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(責任編輯：蔣國良)

EstablishmentandapplicationofduplexPCRmethodforpathogeniccoccidetectioninrawpork

LI Ying-ying, SHAO Liu-yun, LIU Xiao, ZHANG Xiu-fang, HU Hui, WANG Ya-bin, CHEN Li-ying

(College of Animal Husbandry and Veterinary Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

Primers forclfagene of Staphylococcusaureusandsdygene ofStreptococcushemolyticuswere specifically designed. Through reaction optimization and specificity and sensitivity tests, singular and duplex PCR methods were set up, and were then applied to detection of the target bacteria. 126 raw pork samples collected from different places of Zhengzhou city, were analyzed by the PCR method, and conventional microbiological examination was also taken as a control. The results show that the duplex PCR protocol turned out to be specific, effective with a sensitivity of 102ng·L-1. The examination of the raw pork samples showed that 7 out of 126 were detected asStreptococcushemolyticuspositive(5.55%), whilstStaphylococcusaureuswas detected among 8 samples,showing a detection rate of 6.35%.

Staphylococcusaureus;Streptococcushemolyticus; raw pork; duplex PCR; detection

S 851

：A

2014-01-19

河南省重大科技攻關項目(112101110100)；國家質檢總局科技計劃項目(2013QK233)

李英英，1987年生，女，河南洛陽人，碩士研究生，主要從事食源性病原微生物的檢驗與分子生物學研究.

陳麗穎，1967 年生，女，河南南陽人，副教授.

1000-2340(2014)05-0613-06