王述蓮，鄧中平，呼建民，鐘禮立，黃 河

腸道病毒屬于RNA病毒，是引起手足口病的主要病原體。該病毒感染性強(qiáng)、致病率高［1－3］?？焖贆z測(cè)腸道病毒是治療手足口病的重要基礎(chǔ)。目前，國(guó)內(nèi)外常規(guī)檢測(cè)腸道病毒的核酸提取方法是Trizol法，該方法需多次離心、洗滌、吸棄廢液等開(kāi)放操作，過(guò)程中易造成污染和核酸丟失，也易導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性和穩(wěn)定性不理想;而磁珠法是近年來(lái)研發(fā)的一種較為先進(jìn)的腸道病毒核酸提取方法，該方法為常溫裂解釋放核酸，無(wú)需使用水浴或干浴設(shè)備，不必反復(fù)高速離心，操作方便，且節(jié)約成本。本文將腸道病毒核酸的磁珠法提取試劑與常規(guī)Trizol法提取試劑進(jìn)行對(duì)比觀察，即以“新型的”磁珠法腸道病毒核酸提取試劑為觀察試劑，以“常規(guī)的”Trizol法提取試劑為對(duì)照試劑，旨在探討磁珠法試劑的臨床檢測(cè)效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集臨床診斷為手足口病患者的咽拭子標(biāo)本412例，其中男240例，女172例;年齡1～12歲，平均4.5歲。所有病例確診均嚴(yán)格按照國(guó)家衛(wèi)生部頒布的《手足口病診療指南》(2010年版)執(zhí)行［4］。以“新型的”磁珠法腸道病毒核酸提取試劑為觀察試劑，以“常規(guī)的”Trizol法提取試劑為對(duì)照試劑。

1.2 主要試劑和儀器 “新型”腸道病毒核酸檢測(cè)試劑購(gòu)自湖南圣湘生物科技有限公司，采用磁珠法提取腸道病毒核酸，最低檢測(cè)限為400 copies/mL;對(duì)照試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，采用Trizol法提取腸道病毒核酸，采用已上市的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取試劑和反應(yīng)試劑均在檢測(cè)過(guò)程中配套使用。磁珠法和Trizol法提取的腸道病毒核酸，均采用美國(guó)Stratagene公司的Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 方法

1.3.1 磁珠法操作步驟 ①在1.5 mL滅菌離心管中依次加入600μL RNA提取“溶液1”、200μL待測(cè)樣本、100 μL RNA提取“溶液2”，震蕩混勻10 s后，室溫靜置10 min;②瞬時(shí)離心后，將離心管置于分離器上，3 min后吸棄廢液;③向離心管中加入600 μL RNA提取“溶液3”，加入200 μL RNA提取“溶液4”，震蕩混勻5 s，瞬時(shí)離心后將離心管再次置于分離器上，3 min后，將廢液全部吸棄;④向離心管中加入30 μL RNA洗脫液，將離心管壁上磁珠洗脫到管底，室溫靜置10 min后，將離心管再次置于分離器上，靜置3 min，然后將RNA洗脫液移入新的1.5 mL滅菌離心管中。

1.3.2 Trizol法操作步驟 ①在1.5 mL的滅菌離心管中依次加入樣本 500 μL、Trizol試劑 500 μL，充分混勻，室溫放置10 min;②加入200 μL氯仿，擰緊蓋，用力震蕩，直至溶液充分乳化、成乳白狀、無(wú)分相現(xiàn)象，室溫靜置10 min;③于4℃、13 000 r/min離心15 min，吸取上層液相移入另一離心管;④加入等體積異丙醇，輕輕顛倒離心管，充分混勻液體，室溫放置10 min;⑤于4℃、13 000 r/min離心15 min，棄上清;⑥向離心管內(nèi)加入75%乙醇1 mL，震蕩混勻，于4℃、13000 r/min離心10 min，棄上清，在超凈臺(tái)中干燥5 min;⑦向離心管內(nèi)加入試劑盒中的DEPC水 50 μL，充分混勻。

1.3.3 臨床樣本檢測(cè) 分別采用磁珠法試劑和Trizol法試劑，對(duì)412例咽拭子標(biāo)本進(jìn)行臨床樣本核酸提取。①磁珠法提取樣本，是經(jīng)樣本裂解、核酸吸附、雜質(zhì)洗脫后獲得核酸。②Trizol法提取樣本，是經(jīng)樣本裂解，氯仿去雜質(zhì)，離心獲得液相后，采用異丙醇析出核酸，乙醇漂洗，室溫干燥，加水復(fù)溶后獲得核酸。本組412例標(biāo)本均按照上述2種方法的操作步驟，分別提取核酸。爾后，再分別采用各自的檢測(cè)試劑，采用美國(guó)Stratagene公司的Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行核酸檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用Kappa評(píng)價(jià)方法對(duì)磁珠法試劑和Trizol法試劑及復(fù)核檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行診斷的一致性分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為 α=0.05。Kappa值參考評(píng)價(jià)原則:0.75 ＜ κ≤1，診斷一致性好;0.4 ＜ κ≤0.75，診斷一致性一般;0≤κ≤0.4時(shí)，診斷一致性差。以 P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

本研究共檢測(cè)咽栻子臨床樣本412例，分別采用磁珠法和Trizol法的腸道病毒檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取樣本的腸道病毒核酸后，再采用各自的檢測(cè)試劑進(jìn)行檢測(cè)。2種方法檢測(cè)得到的陽(yáng)性和陰例數(shù)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 磁珠法試劑與Trizol法試劑檢測(cè)結(jié)果比較［n(%)］

Kappa檢驗(yàn)的輸出結(jié)果為:κ =0.983，P ＜0.05。磁珠法試劑和Trizol法試劑及復(fù)核檢測(cè)結(jié)果的一致性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示診斷一致性好。

3 討 論

手足口病患者腸道病毒的核酸檢測(cè)步驟，一般是先要提取腸道病毒核酸，爾后再采用熒光定量PCR方法進(jìn)行核酸檢測(cè)。由于熒光定量PCR方法具有高敏感性、高精確性等特點(diǎn)，所以，該方法可用于腸道病毒感染的早期診斷和無(wú)癥狀病毒攜帶者的檢測(cè)［5－7］。但腸道病毒核酸提取方法不同，可導(dǎo)致病毒核酸提取效果的差異，進(jìn)而會(huì)影響該病毒檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究采用磁珠法和Trizol法檢測(cè)同一批412例樣本，雖然磁珠法試劑盒檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性率(33.7%)高于 Trizol試劑盒陽(yáng)性率(33.0%)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示，磁珠法試劑盒與市面常見(jiàn)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果一致性較高。

在樣本核酸的提取過(guò)程中，Trizol法需反復(fù)高速離心，提取步驟比較繁瑣;需使用氯仿、異丙醇等有毒副作用的試劑;需轉(zhuǎn)移液相到新的離心管，該步驟是提取成敗的關(guān)鍵，受到操作人員手法和經(jīng)驗(yàn)等因素的影響，易吸取到中間層和下層的雜質(zhì)，影響到提取效率;在轉(zhuǎn)移樣本的過(guò)程中還易出現(xiàn)樣本間的交叉污染，影響到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。而磁珠法通過(guò)核酸的釋放、磁珠吸附核酸、一步洗滌雜質(zhì)，去除了雜質(zhì)的干擾，可獲得高質(zhì)量的核酸;同時(shí)，磁珠法無(wú)需加熱、轉(zhuǎn)移上清等操作，較易將核酸完整地提取出來(lái)，操作簡(jiǎn)便;提取過(guò)程在一個(gè)封閉的離心管內(nèi)完成，無(wú)需轉(zhuǎn)移液體，可有效防止樣本間的交叉污染，使該方法的準(zhǔn)確性、靈敏度大大提高，降低了對(duì)操作人員的技術(shù)要求，節(jié)省了檢驗(yàn)時(shí)間，可更好地指導(dǎo)醫(yī)師進(jìn)行臨床診斷和治療，在臨床上具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

［1］Lo CW，Wu KG，Lin MC，et al.Application of a molecular method for the classification of human enteroviruses and its correlation with clinical manifestations［J］.J Microbiol Immunol Infect，2010，43(5):354-359.

［2］Oberste M，Schnurr D，Maher K，et al.Molecular identification of new picornaviruses and characterization of a proposed enterovirus 73 serotype［J］.J Gen Virol，2001，82(2):409-416.

［3］Caro V，Guillot S，Delpeyroux F，et al.Molecular strategy for'serotyping'of human enteroviruses［J］.J Gen Virol，2001，82(1):79-91.

［4］衛(wèi)生部.手足口病診療指南(2010年版)［J］.柳州醫(yī)學(xué)，2012，25(2):140-143.

［5］Hamilton MS，Jackson MA，Abel D.Clinical utility of polymerase chain reaction testing for enteroviral meningitis［J］.Pediatr Infect Dis J，1999，18(6):533-537.

［6］Nijhuis M，van Maarseveen N，Schuurman R，et al.Rapid and sensitive routine detection of all members of the genus enterovirus in different clinical specimens by real-time PCR［J］.J Clin Microbiol，2002，40(10):3666-3670.

［7］尤俊斌，蘇鄭明，陳瑋瑩.腸道病毒71型引起手足口病的發(fā)病機(jī)制［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2012，25(8):876-878.