張志堅(jiān)，吳 燦，田 黎，首云峰，彭禮波

0 引 言

作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的除草劑，百草枯自問世以來中毒事件屢有發(fā)生。肺是百草枯作用于機(jī)體最主要的靶器官，肺損傷是百草枯中毒后最常見的致死原因。目前認(rèn)為百草枯中毒后氧化應(yīng)激是肺損傷的主要機(jī)制之一，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)氧化應(yīng)激非常敏感，當(dāng)其穩(wěn)態(tài)被打亂后將導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。研究發(fā)現(xiàn)在ERS反應(yīng)中，ERS相關(guān)蛋白雙鏈RNA依賴性蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PRK-like ER associated kinase，PERK)、肌醇需要酪1α(inositol requiring protein 1-alpha，IRE1α)、活化的轉(zhuǎn)錄因子 4(activating transcription factor 4，ATF4)、X-盒結(jié)合蛋白-1(X-box binding protein 1，XBP1)和活化的轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcriptiong factor 6，ATF6)表達(dá)均會(huì)上調(diào)，其中ATF4和XBP1具有細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)。當(dāng)ERS持續(xù)存在時(shí)，ATF4和XBP1將誘導(dǎo)CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白CHOP，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［1－2］。

沙苑子黃酮(total flavonoids from astragalus complanatus，F(xiàn)AC)是從中藥沙苑子成熟種子中提取的有效成分，具有補(bǔ)益肝腎的功效，其有效成分主要為黃酮類、三萜類及有機(jī)酸，目前已發(fā)現(xiàn)該藥具有抗纖維化、抗衰老、抗腫瘤等作用［3－4］。本研究旨在探討ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在大鼠百草枯中毒后肺損傷中的作用及FAC對(duì)其影響。

1 材料與方法

1.1 百草枯誘導(dǎo)急性肺損傷模型的建立及動(dòng)物分組30只清潔級(jí)Spragne-Dawley(SD)大鼠由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(渝)2011－0002，體重(220±40)g，雌雄各半，飼養(yǎng)溫度18～26℃，光照時(shí)間為12 h/d，飼養(yǎng)清潔級(jí)大鼠顆粒飼養(yǎng)，自由取食。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組，肺損傷模型(ALI)組和沙苑子總黃酮干預(yù)(ALI+FAC)組。ALT組、ALI+FAC組參照采用本課題組已成功建立的百草枯灌胃法(80 mg/kg)復(fù)制大鼠百草枯肺損傷模型［5］。對(duì)照組給予等量等滲鹽水灌胃。從造模后30 min開始，ALI+FAC組即給予FAC［70mg/(kg·d)］灌胃治療，而ALI組和對(duì)照組給予等量等滲鹽水灌胃。于造模后第4天處死所有大鼠。

1.2 生化指標(biāo)的測(cè)定 所有大鼠于實(shí)驗(yàn)開始后第4天3%的戊巴比妥(35 mg/kg)腹腔注射后腹主動(dòng)脈放血處死。處死后取大鼠肺組織放置于－80℃冰箱保存。取右肺組織300 mg制備組織勻漿，采用試劑盒(南京建成生物制品有限公司)測(cè)定SOD、CAT和MDA含量。Lowry法測(cè)定蛋白含量。

1.3 肺組織細(xì)胞凋亡的測(cè)定 采用羅氏公司的TUNEL法凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)原位細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR法分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá) 嚴(yán)格按照RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提取。取RNA樣品2 μg，按RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制反應(yīng)混合液，PCR儀上 37℃反應(yīng) 60 min，產(chǎn)物－20℃保存?zhèn)溆?。?shí)時(shí)定量 PCR，取0.5 μL cDNA作為模板。XBP-1基因(產(chǎn)物103 bp)擴(kuò)增引物對(duì):上游引物5'-CTGCCGCTCATGGTTCCGGG-3'，下游引物5'-TCTCCTCCGGGCTCAGGTGC-3';ATF4基因(產(chǎn)物204 bp)擴(kuò)增引物對(duì):上游引物5'-CCAGGGCCCCACCAGACAGT-3'，下 游 引 物 5'-CGCCAGTGAGGGCTTCCTGC-3';CHOP基因(產(chǎn)物373 bp)擴(kuò)增引物對(duì):上游引物5'-GAGTCTCTGCCTTTCGCCTT-3'，下游引物5'-TCTCATTCACCTGCTCCTTCTC-3';β-actin基因(產(chǎn)物173bp)擴(kuò)增引物對(duì):上游引物5'-GACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3'，下游引物5'-ATAGAGCCACCAATCCACACACAGAG-3'。PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，用凝膠圖像分析儀掃描圖像，進(jìn)行吸光度分析。

1.5 Western blot檢測(cè)各組肺組織CHOP蛋白的表達(dá) 取各組大鼠肺組織各200 mg加入0.5 mL組織蛋白裂解液，勻漿器研麿制成勻漿，離心半徑10 cm，15000 r/min離心20 min。取上清液，按Bradford法測(cè)定蛋白濃度。取100μg樣本，電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)移法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉封閉，分別加入CHOP 1抗(Santa Cruz)(1∶500)置4℃冰箱振蕩孵育過夜。TBST洗膜后，加入HRP標(biāo)記的2抗(1∶20000)室溫反應(yīng)1h。TBST洗滌，ECL化學(xué)發(fā)光試劑于暗室中顯影，X線膠片曝光后拍照。

1.6 HE染色后肺組織形態(tài)學(xué)觀察 每組大鼠任取4只，處死動(dòng)物時(shí)取左上肺組織迅速浸入10%甲醛溶液中固定，經(jīng)二甲苯處理、梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用方差分析及q檢驗(yàn)比較組間差異，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FAC對(duì)肺組織SOD、MDA和CAT的影響大鼠百草枯灌胃4 d后，肺組織MDA水平明顯升高(P＜0.01);FAC治療后MDA水平明顯降低。ALI組與對(duì)照組比較，SOD和CAT活性明顯降低(P＜0.01)，F(xiàn)AC治療后肺組織SOD和CAT活性則明顯升高。見表1。

2.2 FAC對(duì)肺組織 CHOP蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，ALI組肺組織CHOP蛋白表達(dá)上調(diào);經(jīng) FAC處理后肺組織CHOP蛋白表達(dá)明顯下降。見表1，圖1。

2.3 FAC對(duì)肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)的影響 RT-PCT結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，ALI組肺組織XBP-1、ATF4和CHOP mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P＜0.05);與ALI組比較，ALI+FAC組中XBP-1、ATF4和 CHOP mRNA表達(dá)明顯下降(P ＜0.05)。見表1，圖2。

表1 大鼠百草枯灌胃4 d后各組肺組織各指標(biāo)含量比較(，n=10)Table 1 Contents of SOD，CAT and MDA of lung tissues in different groups(，n=10)

表1 大鼠百草枯灌胃4 d后各組肺組織各指標(biāo)含量比較(，n=10)Table 1 Contents of SOD，CAT and MDA of lung tissues in different groups(，n=10)

與對(duì)照組比較，*P ＜0.05、＊＊P ＜0.01;與 ALI組比較，#P ＜0.05、##P ＜0.01

組別 SOD(U/mL) MDA(U/mL) CAT(U/mL) 肺組織CHOP蛋白表達(dá)CHOP XBP-1 ATF4對(duì)照組 300.26 ±35.69 3.26 ±0.24 5.78 ±1.28 0.19 ±0.060.23 ±0.07 0.22 ±0.09 0.11 ±0.04 ALI組 187.21 ±25.66＊＊ 5.04 ±0.36＊＊ 2.15 ±1.12＊＊ 0.64 ±0.19＊＊ 0.74 ±0.20＊＊ 0.97 ±0.27＊＊ 0.55 ±0.09＊＊ALI+FAC 組 260.17 ±45.23*## 3.99 ±0.27## 4.56 ±1.38*## 0.29 ±0.08*# 0.42 ±0.11*## 0.30 ±0.11## 0.25 ±0.08*#

圖1 大鼠肺組織CHOP蛋白表達(dá)Figure 1 Expression of CHOP protein in lung tissues of rats in various groups detected by Western blot

圖2 3組大鼠肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)Figure 2 Expression of ATF4，XBP1 and CHOP mRNA of lung tissues in different groups detected by RT-PCR

2.4 FAC對(duì)肺組織中細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL結(jié)果顯示，ALI組肺組織陽性細(xì)胞數(shù)增多，凋亡細(xì)胞核呈棕黃色，對(duì)照組中僅見個(gè)別凋亡現(xiàn)象，而ALI+FAC組凋亡細(xì)胞明顯減少。見圖3。

圖3 各組肺組織中細(xì)胞凋亡情況(TUNEL×100)Figure 3 Expression of apoptosis in lung tissue of rats(TUNEL×100)

2.5 FAC對(duì)肺組織形態(tài)學(xué)的影響 HE染色后光鏡下對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺泡間隔正常，肺泡腔內(nèi)無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。ALI組光鏡下見肺間質(zhì)和肺泡水腫，可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分可見蛋白滲出。ALI+FAC組肺組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡破壞程度較模型組明顯減輕。見圖4。

圖4 各組大鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)(HE×100)Figure 4 Histopathological pictures in different groups(HE×100)

3 討 論

肺是百草枯中毒的主要靶器官，肺損傷是百草枯中毒后主要并發(fā)癥及死亡原因。目前對(duì)百草枯中毒后肺損傷的機(jī)制仍不十分明確，而尋找有效方式來減輕百草枯中毒后肺損傷仍是十分艱巨的任務(wù)。越來越多的研究表明，ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡參與了很多中毒相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展，如有機(jī)磷農(nóng)藥、重金屬、酒精及某些藥物等［6－9］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為真核細(xì)胞中細(xì)胞鈣離子儲(chǔ)存及蛋白翻譯合成的主要場(chǎng)所，對(duì)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用。而過度的ERS應(yīng)激反應(yīng)則可通過不同的途徑引起組織細(xì)胞的損傷。前期研究中已發(fā)現(xiàn)百草枯中毒后器官損傷與氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系［10－11］。肺組織具有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，故推測(cè)百草枯中毒后肺組織細(xì)胞的損傷可能與其誘導(dǎo)的強(qiáng)烈的ERS反應(yīng)有關(guān)。目前國內(nèi)外研究中對(duì)于百草枯中毒后肺損傷與ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的關(guān)系罕見報(bào)道。

CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白CHOP屬于b-Zip轉(zhuǎn)錄因子之一，正常組織中CHOP表達(dá)非常低。當(dāng)機(jī)體發(fā)生ERS時(shí)，將通過下列途徑上調(diào) CHOP表達(dá)［12－13］:通過活化PERK-eIF2a，引起轉(zhuǎn)錄因子ATF3和ATF4表達(dá)，其中ATF4將結(jié)合氨基酸調(diào)控元件，誘導(dǎo)CHOP表達(dá);內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白IRE和ATF6細(xì)胞質(zhì)活性部分進(jìn)入核內(nèi)，與CCAAT-N9-CCACG連接，啟動(dòng)CHOP轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。而激活的CHOP可能通過Bcl-2表達(dá)的下調(diào)及谷胱甘肽的耗竭來活化Caspase 3，最終引起細(xì)胞凋亡［14－15］。沙苑子為豆科植物扁莖黃芪干燥成熟的種子。在近年的研究中發(fā)現(xiàn)其對(duì)肝、腎、免疫系統(tǒng)及循環(huán)系統(tǒng)均有一定的藥理效應(yīng)。FAC為沙苑子的乙醇提取物，其主要有效成分是黃酮，其主要的藥理作用為抗脂質(zhì)過氧化、抗肝纖維化、誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能及改善血液流變學(xué)［16－17］。但它對(duì)機(jī)體ERS的影響尚未見報(bào)道。

本研究通過肺組織TUNEL染色結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AC干預(yù)后大鼠肺組織細(xì)胞凋亡較ALI組明顯減少，肺組織中氧化應(yīng)激明顯受到抑制(MDA水平明顯降低，SOD和CAT則明顯升高);同時(shí)肺組織病理改變明顯減輕，表明FAC可以增強(qiáng)抗氧化酶的活性。因此說明FAC對(duì)百草枯中毒后肺組織損傷具有保護(hù)作用，且與其抗氧化應(yīng)激密切相關(guān)。

為進(jìn)一步明確百草枯中毒肺損傷機(jī)制及FAC肺保護(hù)的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)研究了ERS相關(guān)基因CHOP、ATF4和XBP-1在各組大鼠肺組織中的表達(dá)情況。RT-PCR結(jié)果表明，百草枯誘導(dǎo)大鼠肺損傷后肺組織中CHOP、XBP-1和ATF4 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，而FAC干預(yù)后上述基因表達(dá)則明顯下調(diào)。Western blot結(jié)果也表明FAC能降低百草枯中毒后肺組織中CHOP蛋白的表達(dá)。綜合上述研究結(jié)果可提示FAC對(duì)大鼠百草枯中毒后肺損傷保護(hù)效應(yīng)可能與減輕ERS反應(yīng)有關(guān)。

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