劉德勇，張慶麗，趙其輝，彭和人，謝海龍

0 引 言

肺癌病死率居于惡性腫瘤首位，5年生存率低。小細(xì)胞肺癌約占肺癌發(fā)病率的20%，其惡性程度高，易發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，且預(yù)后差，對(duì)化療、放療敏感，但易發(fā)生耐藥性［1－2］。目前主要通過(guò)化療延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，但不良反應(yīng)較大，如何改善患者的生活質(zhì)量對(duì)于小細(xì)胞肺癌的治療具有十分重要的意義。

大蒜的主要成分二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)是一種脂溶性有機(jī)硫物質(zhì)，也是大蒜發(fā)揮藥用價(jià)值的主要成分［3］。近幾年來(lái)，DADS在多種腫瘤治療研究中取得了顯著的成果，例如鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病等［4－11］，且大蒜的價(jià)格低廉，是一種非常具有開發(fā)潛力的抗腫瘤藥物。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)前期研究已經(jīng)證實(shí)，DADS對(duì)體外培養(yǎng)的人小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，并且經(jīng)DADS處理后的NCI-H446細(xì)胞形態(tài)亦會(huì)發(fā)生明顯變化，但具體的作用機(jī)制尚不清楚。

本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，建立NCI-H446細(xì)胞裸鼠移植瘤動(dòng)物模型，探討DADS對(duì)肺癌細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用，并研究其作用機(jī)制，為DADS未來(lái)作為新型抗癌藥物應(yīng)用于臨床，提供一定的理論和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康BALB/c-nu裸鼠，雄性，體重16～22g，7周齡(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2007－0001，SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。所有小鼠置于溫度(22±2)℃、濕度(60±5)℃、12 h明暗交替環(huán)境中。人小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞(購(gòu)自上海中科院細(xì)胞中心)，于含有10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。DADS(購(gòu)自Fluka公司)，相對(duì)分子質(zhì)量146.28，純度80%，含10% ～20%DAS。DADS與Tween 80按1∶2的比例混合溶解后，用等滲鹽水稀釋100倍，震蕩混勻，于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩PMI-1640培養(yǎng)基(購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司)，小牛血清(由杭州四季青生物工程公司提供)，碘化丙啶(PI)(購(gòu)自Sigma公司)，吖啶橙(AO)(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)，PCNA抗體、ECL檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自Sant a Cruz公司)，BCA蛋白定量試劑盒(購(gòu)自Pierce公司)，Epics XL流式細(xì)胞儀(Coulter公司生產(chǎn))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 裸鼠成瘤 取裸鼠25只，選取右側(cè)后肢背側(cè)，皮下接種2×106個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H446細(xì)胞。成瘤裸鼠按隨機(jī)列表法分為5組，包括陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組、DADS 20 mg/kg組、DADS 60 mg/kg組、DADS 180 mg/kg組;陽(yáng)性對(duì)照組給予順鉑(DDP)濃度66 mg/kg;陰性對(duì)照組給予等滲鹽水。隔天1次，皮下注射給藥，連續(xù)10次。

繪制生長(zhǎng)曲線:腫瘤長(zhǎng)大一定體積后按組給藥，測(cè)量移植瘤的最大徑(a)及最小徑(b)，然后按公式V=ab2/2，計(jì)算腫瘤體積(V)，并計(jì)算每組動(dòng)物移植瘤體積的平均值，繪制生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，剝離腫瘤，并稱量移植瘤重量，每組取部分移植瘤組織保存于－80℃超低溫冰箱，其余于4%甲醛中固定保存。抑瘤率計(jì)算公式:

抑瘤率=(1－治療組瘤重/對(duì)照組瘤重)×100%

觀察記錄各組裸鼠腫瘤的形態(tài)和大小，將每個(gè)腫瘤剝離并稱重，切取部分組織放入10%甲醛中固定，用于HE染色和免疫組織化學(xué)試驗(yàn)。余下組織冷凍于－20℃冰箱，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.2.2 組織形態(tài)學(xué)觀察 移植瘤固定于4%甲醛中，24 h后，脫水、石蠟包埋、切片。HE染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察移植瘤細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù) 從－80℃冰箱取出移植瘤組織，研磨成均勻漿液，收集細(xì)胞到離心管中，然后以離心半徑13.5 cm、1000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液后，再用預(yù)冷的PBS溶液重懸細(xì)胞，以離心半徑13.5 cm、1000 r/min離心 5 min。組織勻漿過(guò)濾，去除殘?jiān)?，再將?xì)胞重懸于PBS中，以離心半徑13.5 cm、2000 r/min離心10 min，棄去上清。重懸細(xì)胞，加入2mL 0.25%的胰蛋白酶，攪拌10min混勻。用500目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾成細(xì)胞懸液，加入2 mL含有1%新生牛血清的PBS，混勻，以離心半徑13.5 cm、1000 r/min離心5 min，棄去上清。將細(xì)胞再重懸入0.2 mL的PBS中，加入2 mL 4℃預(yù)冷的70%乙醇，固定細(xì)胞，放入冰盒送檢。

將用乙醇固定的細(xì)胞離心洗滌，棄去固定液，再用3mL PBS重懸，400目過(guò)濾網(wǎng)網(wǎng)過(guò)濾1次，離心半徑13.5 cm、1000 r/min 離心 5min。加入 200 μL 1 mg/kg的 RNAase(RNA 酶)50 μL 消化(濃度為 0.5 g/L)，37 ℃ 水浴 30 min，后用 Coulter DNA prepReagents Kit進(jìn)行碘化丙啶(prooidium iodide，PI)染色，振蕩混勻，4℃冰箱避光染色30 min。300目尼龍網(wǎng)濾過(guò)，用Epics XL流式細(xì)胞儀檢測(cè)，檢測(cè)細(xì)胞周期中G1、S、G2/M期細(xì)胞百分率和DNA含量(利用細(xì)胞儀自帶DNA分析軟件分析)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間兩兩比較采用LSD法，率的比較采用χ2檢驗(yàn)方法，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 裸鼠的生長(zhǎng)及成瘤情況 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，裸鼠飲水、進(jìn)食情況正常，無(wú)逃逸，其中陽(yáng)性對(duì)照組、DADS 60 mg/kg組、DADS 180 mg/kg組組各有1只裸鼠死亡。NCI-H446細(xì)胞接種7 d后，形成肉眼可見的移植瘤，14 d后腫瘤生長(zhǎng)到0.1 cm3左右。裸鼠移植瘤境界清晰，有包膜，表面凸凹不平，有結(jié)節(jié)。陰性對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)速度較快，體積較大，其他4組移植瘤生長(zhǎng)速度有所減慢，其中以DADS 180 mg/kg組最為顯著，瘤體積較小。

2.2 DADS對(duì)移植瘤的抑制作用 陰性對(duì)照組的腫瘤生長(zhǎng)速度較快，體積較大，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)有1只裸鼠腫瘤表面形成潰瘍。DADS 180 mg/kg組腫瘤生長(zhǎng)速度較陰性對(duì)照組明顯減慢;其余組腫瘤在用藥后，體積都有明顯縮小。根據(jù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中記錄的瘤體積數(shù)據(jù)，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，可見不同濃度DADS對(duì)移植瘤的生長(zhǎng)均有抑制作用。見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將移植瘤剝離，稱重后計(jì)算抑瘤率，各組的抑瘤率與陰性對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且抑瘤率隨DADS濃度的增加而升高;與陽(yáng)性對(duì)照組比較，DADS 180 mg/kg組抑瘤率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與DADS 20 mg/kg組比較，DADS 60 mg/kg組、180 mg/kg組抑瘤率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，而 DADS 60mg/kg組、180mg/kg組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

圖1 不同濃度DADS治療后裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)情況Figure 1 The growth of xenograft tumors which treated with different concentration DADS

表1 各組裸鼠移植瘤體積和瘤重比較()Table 1 The volume and weight of xenograft tumors treated with DADS()

表1 各組裸鼠移植瘤體積和瘤重比較()Table 1 The volume and weight of xenograft tumors treated with DADS()

與陰性對(duì)照組比較，*P＜0.05;與陽(yáng)性對(duì)照組比較，#P＜0.05;與 DADS 20 mg/kg組比較，△P ＜0.05

組別 n 成瘤率(%) 平均瘤體積(cm3)平均瘤重(g) 抑瘤率(%)5 100 1.17±0.13 0.128 0陽(yáng)性對(duì)照組 4 100 0.64±0.21 0.073 43.0*DADS 20mg/kg組 5 100 0.68±0.22 0.076 40.6*DADS 60mg/kg組 4 100 0.45±0.17 0.060 53.1＊△DADS 180mg/kg組 4 100 0.21±0.20 0.043 66.4＊△#陰性對(duì)照組

2.3 移植瘤形態(tài)學(xué)改變 HE染色后，利用光學(xué)顯微鏡觀察，陰性對(duì)照組瘤細(xì)胞密度大，瘤細(xì)胞排列紊亂，瘤細(xì)胞的形狀主要為圓形或橢圓形，細(xì)胞核的異型性大，染色深，核仁大且明顯，核分裂像增多，核漿比例大，可見明顯的細(xì)胞壞死。而DADS處理組，細(xì)胞密度較小，瘤細(xì)胞排列相對(duì)較規(guī)則，瘤細(xì)胞的形狀主要是多邊形或梭形，瘤細(xì)胞核異型性小，核呈圓形淡染，核仁小而不明顯，核分裂像減少，核漿比例較小。見圖2。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布 利用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)顯示:與陰性對(duì)照組相比，各組移植瘤的細(xì)胞周期分布發(fā)生了顯著改變，處于G2/M期的細(xì)胞數(shù)目顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，各DADS處理組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 DADS對(duì)裸鼠移植瘤細(xì)胞周期的影響(n)Table 2 Effect of DADS on cell cycle in xenografts tumors(n)

圖2 裸鼠移植瘤的細(xì)胞形態(tài)(HE×40)Figure 2 The morphology of xenografts tumors(HE×40)

3 討 論

DADS是從大蒜中提取的主要成分，也是大蒜發(fā)揮抗腫瘤作用的主要物質(zhì)。許多研究顯示DADS對(duì)多種腫瘤都具有抑制作用［4－11］。我們前期的研究證實(shí)，DADS能抑制體外培養(yǎng)的NCI-H446腫瘤細(xì)胞增殖［12］。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，DADS在體內(nèi)能抑制NCI-H446腫瘤細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)。

G1期、S期和G2/M期是細(xì)胞周期調(diào)控的主要時(shí)期，細(xì)胞周期的調(diào)控主要是通過(guò)各種調(diào)控因子的激活和滅活完成的［12－13］。細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程中，尤其是G1/S期和G2/M期的調(diào)控在細(xì)胞發(fā)生癌變的過(guò)程中起著非常重要的作用［14－19］。本研究建立了人小細(xì)胞肺癌裸鼠移植瘤模型，觀察到DADS對(duì)移植瘤的細(xì)胞周期有明顯的阻滯作用，并且流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示:與對(duì)照組相比，各處理組裸鼠移植瘤的細(xì)胞周期均發(fā)生了顯著的改變，G2/M期細(xì)胞數(shù)目明顯增多，提示DADS能改變?nèi)朔涡〖?xì)胞肺癌裸鼠移植瘤的細(xì)胞周期分布，能將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。DADS 180 mg/kg組和陽(yáng)性對(duì)照組阻滯作用最明顯。

綜上所述，DADS能抑制人小細(xì)胞肺癌NCIH446細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，抑制機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的調(diào)控。本研究為DADS未來(lái)應(yīng)用于臨床治療人小細(xì)胞肺癌，提供了一定的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

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