陳小舟，羅佐杰，鄺曉聰，秦映芬，曾文清，黃振興，覃 苑，吳峰萍

0 引 言

三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白G家族成員2(ATP-binding cassette super family G member 2，ABCG2)是能夠?qū)⒕哂胁煌瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和作用于細(xì)胞內(nèi)不同靶點的化療藥物泵出細(xì)胞外，從而介導(dǎo)多種腫瘤的多藥耐藥。腎上腺皮質(zhì)癌是惡性程度極高的腫瘤，對多種化療藥物不敏感，而ABCG2與腎上腺疾病關(guān)系的研究報道尚不多見。本研究通過建立環(huán)磷酰胺體內(nèi)干預(yù)裸鼠移植瘤模型，探討藥物干預(yù)對腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞ABCG2表達(dá)的影響，以期了解ABCG2在腎上腺皮質(zhì)癌耐藥中的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和裸鼠 人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞株SW-13，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。選用4～6周齡、體重為18～22 g的BALB/C-nu裸鼠10只，雌雄不拘，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物合格證號:SCXK桂2003-00。裸鼠飼養(yǎng)在SPF級超凈層流架內(nèi)，保持溫度22℃ ～24℃、濕度45%～50%，籠具、墊料及飼料、飲水均以高壓蒸汽滅菌。將10只裸鼠隨機列表法分為環(huán)磷酰胺組和對照組(注射等滲鹽水)，每組5只。

1.2 主要試劑和設(shè)備 DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(FBS，Hyclone 公司)，胰蛋白酶粉(mresco公司)，環(huán)磷酰胺(山西普德藥業(yè)公司)，鼠抗人ABCG2(Bioword公司)，二抗通用型試劑盒、DAB試劑盒(中杉金橋公司)，PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-human CD338(ABCG2)和 PerCPCyTM5.5 Mouse IgG2b，κIsotype Control(美國 Becton Dickinson公司)，恒溫CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司);普通光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) SW-13細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，并置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.3.2 裸鼠移植瘤模型建立及藥物干預(yù) 參照蔣莉等［1］建立的方法，將處于對數(shù)生長期SW-13細(xì)胞密度調(diào)整為1×107/mL，以0.2 mL/側(cè)劑量注射入裸鼠兩側(cè)腋窩皮下，待瘤體長至可觸及時，環(huán)磷酰胺組腹腔注射環(huán)磷酰胺10 mg/kg，1次/d，連續(xù)3 d，對照組注射同等劑量等滲鹽水。3周后處死裸鼠，取出腫瘤進(jìn)行原代培養(yǎng)。

1.3.3 原代培養(yǎng) 將取出的新鮮瘤體組織剪碎至1 mm3大小，膠原酶Ⅲ(200～250U/mL)及0.25%胰酶消化后用200目濾網(wǎng)過濾，800 r/min離心5 min(離心半徑5.25 cm)、DMEM/F12培養(yǎng)基重懸后種入培養(yǎng)瓶中，并連續(xù)傳3～5代。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù) 取對數(shù)生長期環(huán)磷酰胺組和對照組細(xì)胞，將其消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL后分別移入2個EP管中，每管體積為 100 μL，其中一管加入 5 μL 同型對照(PerCPCyTM5.5 Mouse IgG2b，κIsotype Control)作為對照管，另一管加入5 μL ABCG2熒光抗體(PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-human CD338)為樣本管，避光，室溫孵育30 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.5 免疫組化檢測法 裸鼠皮下移植瘤組織固定、包埋、制成5 μm切片，經(jīng)脫蠟水化后檸檬酸鹽高壓修復(fù)，3%H2O2孵育阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加入鼠抗人ABCG2一抗，4℃孵育過夜，加入二抗孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，封固。用已知陽性片作為陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。高倍鏡下選取5個視野，計數(shù)1000個細(xì)胞，陽性腫瘤細(xì)胞占所有腫瘤細(xì)胞的百分比＜10%者為陰性，≥10%為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 裸鼠移植瘤模型的建立 皮下注射SW-13細(xì)胞8～9 d，裸鼠兩側(cè)腋窩可觸及3 mm大小腫塊，成瘤率為100%。腹腔環(huán)磷酰胺干預(yù)3周后腫瘤直徑達(dá)1.5cm，對照組直徑可達(dá)2cm。腫瘤邊界清楚，包膜完整，分葉呈結(jié)節(jié)狀。見圖1。

圖1 裸鼠環(huán)磷酰胺干預(yù)后皮下移植瘤情況Figure 1 Subcutaneous transplantation tumor after CTX intervention

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測原代培養(yǎng)細(xì)胞ABCG2的表達(dá)水平 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，ABCG2在環(huán)磷酰胺組腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)率［(97.89±1.36)%］高于對照組［(81.88±8.31)%］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.290，P=0.030)。見圖 2。

圖2 ABCG2(CD338)在原代培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)Figure 2 Expression of ABCG2(CD338)in the primarie cultured cells

2.3 免疫組化檢測法檢測ABCG2在裸鼠移植瘤組織中的表達(dá) 移植瘤組織中可見異型性腫瘤細(xì)胞，核大小不一，核分裂像多見。ABCG2陽性細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜呈棕黃或棕褐色顆粒。ABCG2在環(huán)磷酰胺組裸鼠移植瘤組織中的表達(dá)陽性率［(69.1±1.83)%］高于對照組［(53.4 ±1.65)%］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.191，P=0.000)。見圖3。

圖3 ABCG2在移植瘤組織中的表達(dá)(SP×400)Figure 3 Expression of ABCG2 in transplantation tumors(SP×400)

3 討 論

ABCG2首次發(fā)現(xiàn)于乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/Adr-Vp3000，故又稱為乳腺癌耐藥蛋白［2］。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)ABCG2在胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤組織和細(xì)胞中亦有表達(dá)［3－7］。ABCG2具有結(jié)合和水解 ATP 的能力，并利用其提供的能量主動把不同化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用于細(xì)胞內(nèi)不同靶位點的化療藥物(包括蒽環(huán)類、長春花生物堿類、紫衫烷類和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑等)從細(xì)胞內(nèi)泵出，從而使腫瘤對多種抗癌藥物產(chǎn)生抗性。

ABCG2轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)水平及功能的發(fā)揮受多種因素的影響。有研究證明表皮生長因子能通過ERK1/2和JNK/SAPK信號途徑使ABCG2表達(dá)增加，導(dǎo)致對米托蒽醌和拓?fù)涮婵档哪退幮栽黾樱?］。研究表明，通過采用逐步增加體內(nèi)多西他賽濃度的方法可選擇出高表達(dá)ABCG2轉(zhuǎn)運蛋白的耐藥細(xì)胞系(SPC-A1/Docetaxel)［9］。Calcagno 等［10］采用多柔比星單步法和長程法治療可使ABCG2蛋白表達(dá)增加，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，化療藥物通過使ABCG2基因啟動子區(qū)域發(fā)生甲基化，引起ABCG2轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)。因而，ABCG2蛋白表達(dá)增多，細(xì)胞內(nèi)有效化療藥物被泵出，隨后腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥。Turner等［11］研究表明ABCG2與多發(fā)性骨髓瘤患者多藥耐藥性及預(yù)后存在相關(guān)性。近年來，藥物體內(nèi)干預(yù)裸鼠移植瘤模型已成為新的耐藥模型被廣泛運用于多種腫瘤耐藥機制的研究［12－14］，其較體外耐藥模型更好地說明臨床耐藥機制的形成。本研究通過建立腎上腺皮質(zhì)癌SW-13細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，并予環(huán)磷酰胺腹腔注射干預(yù)，使腫瘤暴露于化療藥物作用環(huán)境。流式檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ABCG2在環(huán)磷酰胺組腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)陽性率高于對照組。免疫組化結(jié)果進(jìn)一步證實環(huán)磷酰胺干預(yù)后移植瘤組織ABCG2的表達(dá)增加。以上結(jié)果提示，ABCG2很可能參與腎上腺皮質(zhì)癌耐藥。由于化療的作用殺死ABCG2陰性表達(dá)即不具備耐藥能力的腫瘤細(xì)胞，而在藥物治療的間隙存活的腫瘤細(xì)胞使其子代細(xì)胞不斷增殖，表達(dá)ABCG2的細(xì)胞增多，進(jìn)而行使其“藥物泵”功能，導(dǎo)致腫瘤獲得性耐藥的形成。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，ABCG2在對照組裸鼠移植瘤組織及原代培養(yǎng)的細(xì)胞亦有較高的表達(dá)，其高表達(dá)可能為腎上腺皮質(zhì)癌原發(fā)性高度耐藥的原因。ABCG2可能為腎上腺皮質(zhì)癌的干預(yù)靶點，但ABCG2參與腎上腺皮質(zhì)癌耐藥相關(guān)機制仍需進(jìn)一步研究。

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