周游+孫伏喜+周蓉+等

【摘要】 目的：探討caveolin-1通過介導(dǎo)TGF-β信號通道在體外調(diào)控小鼠肺細(xì)胞外基質(zhì)重塑的機制研究。方法：選取cav1-/-小鼠作為動物模型設(shè)為實驗組，野生型C57BL/6J小鼠設(shè)為對照組，檢測肺機械性指標(biāo)，測定Ⅰ型膠原纖維與彈性纖維含量及mRNA水平，檢測肺血管蛋白滲出及支氣管灌洗液（BAL）中細(xì)胞含量及細(xì)胞因子水平，測定TGF-β下游信號分子Smad2及ERK1/2水平。結(jié)果：與對照組比較，實驗組中肺順應(yīng)性下降，僵硬度增加（P<0.05）；BAL中總蛋白及白蛋白水平和靜脈注射伊文思藍在肺組織的含量均明顯增加（P<0.05）；Ⅰ型膠原纖維與彈性纖維含量及mRNA水平增加（P<0.05）；Smad2及ERK1/2水平均明顯提高（P<0.05）；但BAL中細(xì)胞含量及細(xì)胞因子水平無差異。結(jié)論：小窩蛋白1通過介導(dǎo)TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在體外上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)重塑，促進肺纖維化發(fā)生。

【關(guān)鍵詞】 小窩蛋白1； TGF-β； 細(xì)胞外基質(zhì)； 信號傳導(dǎo)； 肺纖維化

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是ICU常見的且死亡率高的一種急癥狀態(tài)，近年來隨著機械通氣、表面活性物質(zhì)替代療法等新技術(shù)應(yīng)用，其存活率已顯著提高。然而，長時間吸入高濃度氧，幸存者易發(fā)生肺部氧化應(yīng)激損傷。目前，高氧肺損傷及肺纖維化已成為ICU最為棘手的問題之一和慢性肺疾病的最常見形式，但目前高氧肺損傷及肺纖維化的確切機制尚未完全闡明。已知細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的重塑參與了高氧肺損傷的整個病理過程，若ECM重塑正常，則損傷完全修復(fù)，肺結(jié)構(gòu)正常；若ECM重塑紊亂，將導(dǎo)致肺纖維化。因此，ECM重建是關(guān)系高氧肺損傷結(jié)局的關(guān)鍵因素。

目前已知在Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等細(xì)胞質(zhì)膜上存在約50～100 nm大小的囊性凹陷結(jié)構(gòu)——小窩（caveolae），而小窩蛋白（caveolin，cav）1是小窩胞漿面包被的一種21～24 kD的膜蛋白，是許多信號分子如TGF-β活性狀態(tài)的重要調(diào)節(jié)者。TGF-β是一種多效生長因子，可以調(diào)控細(xì)胞生長、分化、程序性死亡及ECM產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，cav1可以通過調(diào)節(jié)TGF-β受體表達從而調(diào)控TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[1-2]。在變異原誘發(fā)的急性肺損傷小鼠模型中，cav1對肺間質(zhì)纖維化、肺泡支氣管化及氣道重塑有重要作用，并且發(fā)現(xiàn)TGF-β信號增強，膠原分泌增加[3-5]。有研究報道，cav1基因敲除小鼠出現(xiàn)肺泡腔狹窄、肺泡壁增厚及細(xì)胞過多現(xiàn)象[6]。故推測cav1可以通過介導(dǎo)TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以此調(diào)控ALI/ARDS時的ECM重塑水平。本研究應(yīng)用cav1-/-小鼠模型探討Cav1對ECM重塑作用及其具體信號機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型、主要試劑及分組 本實驗分為兩組：（1）實驗組：實驗動物為1周齡C57BL/6J cav1-/-小鼠，購自美國Jackson實驗室；（2）對照組：實驗動物為1周齡野生型C57BL/6J小鼠，購自南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。每組均為15只小鼠。主要試劑：Sircol膠原測定盒購自北京友誼中聯(lián)生物科技有限公司。RNeasy RNA試劑盒購自美國QIAGEN試劑公司。細(xì)胞裂解液購自美國Sigma試劑公司（含1 mM DTT、1×蛋白酶抑制劑混合物、5 mM EDTA）。

1.2 肺機械性測量 動態(tài)順應(yīng)性及彈性回縮力參數(shù)通過強迫振蕩法flexiVent呼吸功能研究系統(tǒng)獲得。小鼠按體重予以氯胺酮（100 mg/kg）及甲苯噻嗪（10 mg/kg）靜脈麻醉后插氣管套管后連接flexiVent儀器通暢，參數(shù)設(shè)定如下：PEEP設(shè)定為2 cm H2O，呼吸頻率為150次/min，潮氣量為7.5 mL/kg。氣道阻力、順應(yīng)性及彈性回縮力測定15次，應(yīng)用單室腔模式進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)測定后處死小鼠，支氣管肺泡灌洗后取肺組織標(biāo)本，以進行RNA及蛋白提取。

1.3 組織學(xué)檢查及膠原沉著測定 肺組織標(biāo)本固定于4%多聚甲醛，包埋切片后予以天狼星紅染色，在光鏡下觀察組織標(biāo)本，利用ImagePro圖像分析儀測定肺實質(zhì)及氣道周圍的膠原含量。

取肺組織冰凍后應(yīng)用Sircol膠原測定試劑盒測定膠原沉著水平。50 mg肺組織均勻攪碎于500 μL的提取液并4 ℃攪拌過夜，組織勻漿在4 ℃高速離心（15 000 g）1 h，按照試劑盒說明操作，用分光光度儀在540 nm波長測定光密度，對比標(biāo)準(zhǔn)膠原含量曲線圖得出膠原含量。

1.4 肺血管滲出測定 對小鼠行支氣管灌洗術(shù)后取灌洗液，在20 ℃時1000 g低速離心10 min后取上清液儲存于-80 ℃環(huán)境，測定肺組織滲出總蛋白及白蛋白含量?？偟鞍缀坎捎肂radford法測定，白蛋白測定應(yīng)用小鼠白蛋白ELISA試劑盒方法測定。

應(yīng)用伊文思藍注射后計算伊文思藍含量來評價肺血管通透性。取3月齡小鼠麻醉后按20 mg/kg劑量尾靜脈注射伊文思藍，注射1 h后處死小鼠，開胸后左心室灌注5 mL PBS。取出肺組織，攪碎成組織勻漿固定于10%甲酰胺60 ℃孵育12～18 h，5000 g離心30 min后收集上清液，測定620 nm和720 nm吸收率。伊文思藍含量（每克肺組織中伊文思藍毫克含量）按下列公式計算：A620 -（1.426×A720+0.030），結(jié)果對比伊文思藍標(biāo)準(zhǔn)曲線得出伊文思藍含量。

1.5 支氣管灌洗液（BAL）中細(xì)胞含量及細(xì)胞因子水平 兩組BAL在20 ℃ 1000 g離心10 min后收集細(xì)胞沉積，在100 μL的PBS中打勻，使用標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞計數(shù)板來計算總細(xì)胞數(shù)。分別應(yīng)用小鼠Th1/Th2細(xì)胞因子ELISA試劑盒測定BAL中細(xì)胞因子IL-2、TNF-α及IFN-γ。endprint

1.6 彈性纖維沉著測定 利用免疫組化方法檢測彈性纖維，切片用5%山羊血清封閉1 h，用彈力蛋白一抗4 ℃孵育過夜，在PBS及0.05% Tween-20清洗3次，再與Alexa Fluor 568標(biāo)記的二抗孵育過夜，細(xì)胞核用DAPI復(fù)染。切片包被后在熒光顯微鏡下觀測。

1.7 RNA及蛋白表達分析 應(yīng)用RNeasy RNA試劑盒從肺組織標(biāo)本中提取RNA，按試劑盒說明操作。RNA標(biāo)本在20 ℃與0.05 U/mL DNase Ⅰ孵育15 min，應(yīng)用定量RT-PCR法測定Ⅰ型膠原α2鏈（col1α2）及彈性蛋白原（eln）mRNA水平。

肺冰凍標(biāo)本用冰PBS液沖洗3次后，組織勻漿加入0.5 mL細(xì)胞裂解液直接煮沸5 min，冰上冷卻后，12 000 rpm離心15 min，取上清液，按照Western blot試劑盒的說明操作，分別加入小鼠anti-Smad2抗體及小鼠anti-ERK1/2抗體后，4 ℃搖擺過夜。漂洗3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG多克隆抗體避光室溫孵育2 h，按照發(fā)光試劑盒的說明操作，X線曝光后應(yīng)用NIH Image凝膠圖像處理系統(tǒng)分析凈光密度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.5軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較用t 檢驗或ANOVA分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組肺機械性變化測定結(jié)果的比較 實驗顯示，實驗組小鼠的肺順應(yīng)性較對照組明顯降低，與此相反實驗組小鼠的肺彈性回縮力及氣道阻力較對照組均明顯增加（P<0.05）。結(jié)果表明，實驗組小鼠肺的僵硬度明顯增加。

2.2 肺組織膠原纖維沉著檢測 實驗組小鼠的氣道周圍及肺實質(zhì)膠原纖維沉著較對照組均明顯增加（P<0.05），見圖1。并且在應(yīng)用Sircol法對組織勻漿測定膠原纖維含量結(jié)果顯示，實驗組的膠原纖維含量為（41.2±5.4）μg/mg，而對照組小鼠為（27.7±3.1）μg/mg，表明實驗組較對照組明顯增加（P<0.05）。說明實驗組小鼠肺的膠原纖維沉著明顯增加，也是肺僵硬度增加的病因之一。

2.3 肺血管蛋白滲出及伊文思藍含量測定 肺血管滲出過多也是肺僵硬度增加的病因之一，故檢測BAL中蛋白滲出水平及肺實質(zhì)伊文思藍積聚可以反映肺血管滲出狀況。實驗組小鼠BAL中總蛋白及白蛋白水平較對照組均明顯增加（P<0.05），且靜脈注射伊文思藍在肺組織含量也較對照組明顯增加（P<0.05），見圖2。

2.4 兩組BAL中細(xì)胞含量及細(xì)胞因子水平測定結(jié)果的比較 在對BAL中細(xì)胞含量檢測顯示兩組無明顯差異（P>0.05），并且兩組中細(xì)胞因子如IL-2、TNF-α及IFN-γ也無明顯差異（P>0.05）。結(jié)果表明，cav1-/-小鼠與野生型小鼠肺組織無明顯炎癥差別。

2.5 col1α2及eln的mRNA水平與彈性纖維沉著測定 實驗組小鼠肺組織中I型膠原α2鏈（col1α2）及彈性蛋白原（eln）mRNA水平均明顯高于對照組標(biāo)本水平（P<0.05）。熒光顯微鏡下觀測顯示，實驗組的肺實質(zhì)及肺泡壁的彈性纖維分布較對照組均明顯增加。結(jié)果表明實驗組小鼠的肺組織彈性纖維沉著明顯增加。

2.6 TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)表達水平測定 已知cav1-/-小鼠缺乏cav1會上調(diào)TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而TGF-β是ECM基因轉(zhuǎn)錄活性主要的調(diào)節(jié)因子。TGF-β下游的信號通路主要為Smad2和ERK1/2，故本研究應(yīng)用Western blot法檢測肺組織中Smad2和ERK1/2水平。結(jié)果顯示，實驗組中Smad2和ERK1/2水平較對照組均明顯升高（P<0.05）。結(jié)果說明TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)Smad2和ERK1/2在cav1-/-小鼠上調(diào)。

3 討論

長期以來，有關(guān)小窩蛋白1（cav1）的研究主要集中在膽固醇代謝、腫瘤轉(zhuǎn)移、膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面，而在急性肺損傷（acutelung injury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）所致肺纖維發(fā)病機制的研究較為少見。研究發(fā)現(xiàn)，cav1廣泛存在于肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞膜，對于形成囊性凹陷結(jié)構(gòu)——小窩（caveolae）至關(guān)重要，而小窩內(nèi)含有多種信號受體，其中TGF-β信號通路對于ECM沉著、肺內(nèi)皮細(xì)胞分化及相關(guān)病理狀態(tài)至關(guān)重要[3]。為了解cav1對肺的生理功能及結(jié)構(gòu)影響，本研究探討了肺功能、TGF-β信號通路及ECM重塑間關(guān)系。已有研究顯示，cav1缺乏或降低可以上調(diào)TGF-β水平，而體外培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞時予以外源性TGF-β則可以上調(diào)數(shù)個ECM基因轉(zhuǎn)錄[3，7-8，10]。cav1-/-小鼠的肺功能出現(xiàn)有害改變，因而了解TGF-β信號系統(tǒng)改變是否也會造成ECM重塑成了需要解決的問題。Ⅰ型膠原纖維和彈性纖維是ECM重要成員，也是決定肺順應(yīng)性重要因素[11]，因而本研究選取I型膠原纖維和彈性纖維作為研究ECM重塑對象。研究中發(fā)現(xiàn)，cav1-/-小鼠相比與野生型小鼠，其肺順應(yīng)性下降，而肺彈性回縮力及氣道阻力增加，表明肺的僵硬度增加，這與肺的ECM增加及肺血管滲出增加相關(guān)[12-13]。實驗中分別對肺組織的Ⅰ型膠原纖維和彈性纖維含量檢測，顯示cav1-/-小鼠產(chǎn)生ECM是明顯升高，這一點不論從組織切片還是轉(zhuǎn)錄水平都得到了證實。

同時研究中顯示，cav1-/-小鼠的支氣管灌洗液蛋白滲出也明顯增加，并且在應(yīng)用伊文思藍靜脈注射后滲透至肺組織含量明顯增加也證實cav1-/-小鼠的肺血管通透性增加。在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中，30%細(xì)胞表面存在小窩，因而cav1缺陷會增加肺血管通透性，促進滲出[14]。已知在正常人的血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)TGF-β可以上調(diào)NO合成酶的活性，而NO合成酶產(chǎn)生的NO會增加血管通透性，故TGF-β被認(rèn)為是直接導(dǎo)致肺水腫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物[15-16]。而cav1可以下調(diào)TGF-β信號水平，因而可以推測cav1-/-小鼠肺組織中血管滲出增加是因TGF-β過度激活而致使NO合酶活性過強所致。endprint

本研究從以上兩方面證實cav1可以調(diào)控肺組織ECM重塑水平，進而影響肺的順應(yīng)性變化。已知cav1可以調(diào)節(jié)TGF-β表達水平，但為進一步了解cav1是否通過TGF-β信號系統(tǒng)來調(diào)控ECM重塑，研究選取了TGF-β的兩個重要下游信號因子Smad2和ERK1/2作為研究對象。有研究表明，各種的TGF-β下游信號途徑如Smads、ERK1/2及p38 MAPK等對調(diào)控彈性纖維mRNA及轉(zhuǎn)錄后穩(wěn)定有重要作用，比如Smad3缺乏則會導(dǎo)致肺彈性纖維表達抑制進而出現(xiàn)肺氣腫[17-18]。研究結(jié)果顯示，cav1-/-小鼠的Smad2和ERK1/2表達明顯增加，證實cav1介導(dǎo)TGF-β信號系統(tǒng)調(diào)控肺ECM重塑。

cav1-/-小鼠具有ALI/ARDS相似的病理特點，如肺膠原積聚、血管通透性增加及肺順應(yīng)性下降等，因而充分了解cav1功能具有很好的臨床相關(guān)性，也為治療ALI/ARDS提供一個潛在的新型治療靶向。

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（收稿日期：2014-02-12） （本文編輯：歐麗）endprint

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