張曉晴，韋東普，李 波，李菊梅，陳世寶，馬義兵, *

1. 湖北民族學(xué)院林學(xué)園藝學(xué)院，湖北 4450002. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所 國家土壤肥力與肥料效益監(jiān)測站網(wǎng)，北京 100081

土壤水溶態(tài)銅對小白菜的毒害效應(yīng)及其預(yù)測模型

張曉晴1, 2，韋東普2，李 波2，李菊梅2，陳世寶2，馬義兵2, *

1. 湖北民族學(xué)院林學(xué)園藝學(xué)院，湖北 4450002. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所 國家土壤肥力與肥料效益監(jiān)測站網(wǎng)，北京 100081

土壤中銅(Cu)重金屬的生物毒性/有效性主要取決于它們在土壤液相中含量和土壤溶液的性質(zhì)。探尋土壤有效態(tài)Cu的生物毒害效應(yīng)，表征量化其與土壤溶液性質(zhì)關(guān)系，可為土壤Cu的環(huán)境風(fēng)險評價提供參考。選取17種典型農(nóng)田土壤，探討了有效態(tài)Cu(土壤孔隙水以及CaCl2浸提態(tài))對小白菜生長的毒性效應(yīng)及其預(yù)測模型。結(jié)果表明：土壤孔隙水中Cu對小白菜生長10%抑制的毒性閾值(EC10)和50%抑制的毒性閾值(EC50)，最大值與最小值相差為14.7和14.6倍；同樣，對于CaCl2提取態(tài)Cu的EC10和EC50，最大值與最小值相差12.7和7.7倍，表明土壤溶液性質(zhì)對水溶性Cu對小白菜的毒性閾值影響很大。建立了土壤溶液的重要因子(溶解性有機(jī)碳、土壤溶液pH值、電導(dǎo)率、全硫含量、Ca2+、Mg2+、K+、Na+)和水溶性Cu閾值之間的多元回歸關(guān)系，結(jié)果顯示，土壤溶液性質(zhì)可以較好地預(yù)測水溶性Cu對小白菜的毒性閾值。同時，土壤溶液中Mg2+、K+和S的含量是控制孔隙水中Cu對小白菜生長毒性的最重要因子，單一的S能分別解釋34%的EC10變異，K+解釋26%的EC50變化。本研究結(jié)果可為陸地環(huán)境中水溶性Cu的風(fēng)險評價提供基礎(chǔ)。

土壤；銅；毒害效應(yīng)；小白菜

小白菜是一種含豐富的礦物質(zhì)和維生素的葉菜類蔬菜，在我國栽培十分廣泛。隨著農(nóng)田土壤重金屬的污染加劇，葉菜類蔬菜最易受重金屬污染的影響[1]，其中小白菜對重金屬銅(Cu)的毒害作用表現(xiàn)比較敏感[2]。李波[2]研究發(fā)現(xiàn)，在8種常見的農(nóng)田作物(大麥、水稻、西紅柿、青椒、小白菜、芥菜、菠菜和芹菜)中，小白菜是對Cu毒性比較敏感的蔬菜品種。Cu作為植物的營養(yǎng)元素，當(dāng)土壤中含量較低時，能促進(jìn)小白菜的生長，而當(dāng)土壤中Cu的濃度進(jìn)一步增加，則抑制小白菜的生長。研究表明，當(dāng)溶液中的Cu含量較高時，小白菜生長受到脅迫，葉綠素a和b的含量下降，光合和呼吸作用受阻；植物細(xì)胞中的超氧化物歧化酶等活性降低或遭到破壞，自我調(diào)節(jié)能力下降；小白菜根系活力大幅降低，根系吸收能力也隨之下降等[3]。為建立土壤環(huán)境中Cu的生態(tài)閾值，查明不同類型土壤和植物相應(yīng)的Cu毒性臨界值是非常必要的。Li等[4]研究不同類型土壤中外源銅對小白菜生長的毒害效應(yīng)時，發(fā)現(xiàn)Cu的毒性閾值變化范圍較大。而關(guān)于土壤溶液性質(zhì)對于土壤有效態(tài)Cu對小白菜毒害效應(yīng)影響的研究較少。因此，本文以小白菜為試驗材料，比較和確定17個中國農(nóng)田土壤中水溶性Cu(土壤孔隙水和0.01 mol·L-1CaCl2提取液態(tài))對小白菜的毒害效應(yīng)，并找出控制水溶性Cu毒性的土壤溶液主控因子和建立其預(yù)測模型，為土壤中Cu的生態(tài)風(fēng)險評價提供參考依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗方法

本試驗選取的全國17個位點農(nóng)田土壤，其土壤處理方法及土壤性質(zhì)測定見Li等[4, 5]。土壤理化性質(zhì)變化范圍為：有機(jī)碳0.60%～4.28%，pH 4.93～8.90，有效陽離子交換量6.36～33.59 cmol·kg-1，粘粒含量10%～66%。

將CuCl2溶液均勻噴布到土壤上，pH值<5的每千克干土中Cu的添加量分別為0、12.5、25、50、100、200、400、800 mg；在pH值5 ～ 7的土壤中，Cu的添加量分別為0、25、50、100、200、400、800、1 600 mg；在pH>7的每千克土壤中，Cu的添加量分別為0、37.5、75、150、300、600、1 200、2 400 mg。保證土壤水分維持最大田間持水量，培養(yǎng)2 d，風(fēng)干，過2 mm尼龍篩備用。

盆栽試驗在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室中進(jìn)行。供試作物小白菜(BrassicachinensisL.)，參照ISO 11269-2(1995)，在植物生長缽中添加650 g處理過的土壤樣品，保持60%的最大田間持水量，培養(yǎng)7 d后，種植預(yù)發(fā)芽(胚根<5 mm)的小白菜種子，置于溫室內(nèi)生長21 d。小白菜生長期間，土壤水分維持田間持水量的60%～ 65%，白天溫度為26～32 ℃(14～16 h)，夜間18～24 ℃(8～10 h)。小白菜收獲后，取其地上部分放入烘箱(70 ℃)，烘48 h后，稱量莖葉生物質(zhì)量。所有處理均設(shè)置3次重復(fù)。

1.2 土壤溶液參數(shù)測定方法

土壤溶液測定方法具體參考李波[2]。在小白菜毒理實驗開始前，土壤添加外源Cu平衡2 d后，便開始提取土壤溶液。土壤溶液采用國際標(biāo)準(zhǔn)雙室離心方法提取[6]，將25 g風(fēng)干土壤放入墊有石英棉的注射器內(nèi)部，添加去離子水保持土壤持水量為pF 1.7，培養(yǎng)過夜(24 h)，低速離心(3 500 r·min-1) 45 min，收集土壤孔隙水，繼續(xù)高速離心(15 000 r·min-1) 45 min，保留上清液，過0.45 μm的濾膜，電感藕合等離子體-原子發(fā)射光譜(ICP-AES)或電感藕合等離子體-質(zhì)譜(ICP-MS)測定濾液中Cu以及其它主要的元素(Na、K、Ca、Mg、S)的含量。土壤溶液中pH值、電導(dǎo)率(EC)和溶解性有機(jī)碳(DOC)分別采用pH計、電導(dǎo)率測定儀、Formacs全碳檢測儀測定。

采用CaCl2提取(0.01 mol·L-1)，土液比為1：5，3 500 r·min-1離心振蕩，浸提的時間為30 min，0.45 μm的濾膜過濾，取上清液，ICP-AES法測定Cu含量。

實驗測得土壤溶液的基本理化性質(zhì)為：DOC 53～623 mg·L-1，pH 4.9～8.4，EC 0.53～11.36 mS·cm-1，Ca2+50.4～1 359 mg·L-1，Mg2+11.4～483 mg·L-1，Na+6.15～2 128 mg·L-1，K+1.6～51.5 mg·L-1，S 3.45～721 mg·L-1，具體描述見張曉晴[7]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

水溶性Cu的毒性閾值(ECx，x=10，50)和土壤溶液性質(zhì)之間的多元回歸數(shù)據(jù)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，回歸方程中參數(shù)因子的顯著性水平為p≤ 0.05。

水溶性Cu對小白菜的毒害效應(yīng)采用log-logistic曲線擬合[8]，方程如下：

(1)

式中，Y為相對小白菜地上部分的干重(%)，X為lg(水溶性Cu的濃度)。Y0、M、b為擬合的參數(shù)，M為lg(ECx(10，50))。EC10和EC50分別為小白菜生物量減產(chǎn)10%和50%時水溶性Cu的濃度。通過此方程也可以求得ECx95%的置信區(qū)間。

2 結(jié)果(Results)

2.1 銅對小白菜的毒性效應(yīng)

本試驗中，在少數(shù)土壤中發(fā)現(xiàn)低濃度水溶性銅略微增加了小白菜產(chǎn)量，其中最大增加量為對照的114%。但當(dāng)土壤中水溶性銅濃度的進(jìn)一步增加時，小白菜的生長逐漸受到抑制，有些土壤中當(dāng)銅的添加量最高時，小白菜無法生長，其土壤中水溶性銅的濃度和小白菜地上部分的相對干重可以用log-logistic劑量效應(yīng)曲線很好地進(jìn)行擬合(圖1和2)。孫權(quán)等[3]也發(fā)現(xiàn)當(dāng)土壤中銅的濃度較低時，小白菜地上部分產(chǎn)量有增加的趨勢，此時根系體積有增大的趨勢，從而增加對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

圖1 孔隙水中銅對小白菜生長的劑量-效應(yīng)曲線(土壤位點編號S1-S17見表1)Fig. 1 Dose-response curves for Cu concentrations in soil pore water samples for bok choy

圖2 CaCl2提取液中銅對小白菜生長的劑量-效應(yīng)曲線(土壤位點編號S1-S17見表1)Fig. 2 Dose - response curves for Cu concentrations in CaCl2 extraction for bok choy

依據(jù)劑量效應(yīng)曲線計算的小白菜減產(chǎn)10%和50%的土壤水溶性銅的毒性閾值(EC10，EC50)，見表1所示。結(jié)果表明，土壤孔隙水中Cu對小白菜的毒性閾值EC10和EC50，變化范圍分別為0.03～0.44 mg·L-1和0.07～1.02 mg·L-1，最大值與最小值的差異分別為14.7和14.6倍。CaCl2提取液中Cu的毒性閾值EC10和EC50的變化分別是0.06～0.76 mg·kg-1和0.23～1.78 mg·kg-1，最大值與最小值的差異分別為12.7和7.7倍。在同一套土壤中，Li等[4]發(fā)現(xiàn)土壤中外源Cu對小白菜的毒性閾值EC10和EC50的變化范圍較大，最大值與最小值的比值分別為37.4和9.5[2]。與土壤外源Cu的毒性閾值變化范圍相比，17個土壤的水溶性Cu毒性閾值EC10變化范圍明顯縮小，說明用水溶性銅作為銅毒性閾值指標(biāo)可以降低部分土壤性質(zhì)對Cu毒害的影響；而對于EC50，水溶性Cu閾值變化范圍并沒有顯著縮小，說明毒性閾值受土壤性質(zhì)影響較大。這些結(jié)果說明即使水溶性銅也不能完全作為土壤銅毒性閾值指標(biāo)，仍然受土壤性質(zhì)或者土壤溶液性質(zhì)的影響。

2.2 銅對小白菜的毒性閾值的預(yù)測模型

評價土壤溶液性質(zhì)對水溶性銅的毒性閾值的影響，探索能適用于不同的土壤性質(zhì)的預(yù)測模型，可為制定符合中國土壤質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和風(fēng)險評價提供的參考依據(jù)。應(yīng)用SPSS 19.0軟件多元回歸分析了土壤溶液性質(zhì)(pH值、EC、K+、Na+、Ca2+、Mg2+、S、DOC)和土壤水溶性Cu對小白菜的毒性閾值EC10、EC50之間的關(guān)系，其簡單和多元的回歸方程的主要顯著結(jié)果如表2所示。Mass[9]研究表明，小白菜屬于對鹽害一般敏感的蔬菜，其對電導(dǎo)率的臨界值為1.8 mS·cm-1，在本實驗中內(nèi)蒙古土壤(S12)溶液中電導(dǎo)率為高達(dá)11.4 mS·cm-1， Na+的濃度也達(dá)到了2 128 mg·L-1，小白菜的生長受到鹽脅迫的影響較大，從而影響水溶性Cu的毒性閾值。因此，在多元回歸中，只分析其余16個土壤溶液性質(zhì)和毒性閾值之間的關(guān)系。

表1 17種土壤水溶性銅對小白菜生長的毒性閾值Table 1 Toxicity thresholds measured by bok choy shoot for Cu in soil pore water and CaCl2 extraction for 17 Chinese soils

注: a為毒性閾值95%的置信區(qū)間；EC10和EC50分別為與對照相比小白菜地上部分生物量減少10%與50%時，土壤孔隙水或CaCl2提取液中Cu的濃度。

Note: a was the range of 95% confidence intervals;EC10andEC50represented the effective soluble Cu concentrations that caused 10% and 50% inhibition for bok choy shoot growth based on soluble Cu concentration in soil pore water and CaCl2extraction , respectively.

表2 基于土壤溶液性質(zhì)和小白菜生長銅毒害閾值的簡單和多元回歸方程(n=16)Table 2 Simple and multiple linear regressions from bok choy shoot bioassay between soluble Cu toxicity thresholds and soil pore water chemistry (n=16)

注：EC為電導(dǎo)率；EC10和EC50分別為與對照相比小白菜地上部分生物量減少10%與50%時，土壤孔隙水或CaCl2提取液中Cu的濃度；P：回歸方程中系數(shù)的顯著性水平，*：5%水平顯著，**：1%水平顯著，***：1‰水平顯著。
Note: EC was the electrical conductivity;EC10andEC50represented the effective soluble Cu concentrations that caused 10% and 50% inhibition for bok choy shoot growth based on soluble Cu concentration in soil pore water and CaCl2extraction, respectively; p: significant level of variances in regression equations, *: 5% significant level, **: 1% significant level, ***: 1 significant level.

對于控制土壤孔隙水中Cu對小白菜毒害的最重要的土壤溶液性質(zhì)為K+、Mg2+和S。例如，單一的S能分別解釋34%的EC10變異，單一的K+能分別解釋26%的EC50變異。土壤溶液性質(zhì)對CaCl2提取態(tài)Cu的小白菜毒性影響與孔隙水中Ni的有一些差異，除了K+，土壤溶液pH值也是非常重要的土壤溶液性質(zhì)，例如，單一的pH值可以控制大約35%和53%的EC10和EC50的變化。通過對比可以發(fā)現(xiàn)，CaCl2提取態(tài)Cu對小白菜的毒性閾值更容易受到土壤溶液性質(zhì)的影響，尤其是土壤溶液pH值和K+濃度。

3 討論(Discussion)

3.1 土壤溶液性質(zhì)對銅植物毒性的影響

影響孔隙水中Cu的毒性閾值的土壤溶液性質(zhì)顯著因子有Mg2+、K+和S，其中最重要的是K+和S，其次為Mg2+。從表2回歸方程(1 ～ 4)可以看出，它們與Cu的毒性閾值顯著正相關(guān)，即隨著它們濃度的增加，Cu對小白菜的毒害作用有下降的趨勢。與小白菜不同的是，土壤溶液性質(zhì)對大麥和西紅柿的Cu毒害效應(yīng)影響存在一定的差異。土壤溶液中DOC含量最容易影響Cu對大麥根伸長毒害作用[11]，而Ca2+、Mg2+、DOC對西紅柿的毒害影響最大[7]。由此可以看出，在同一套土壤中，由于植物品種間的差異，控制水溶性Cu毒性的土壤溶液性質(zhì)也存在一定的差異，因此，對于不同的植物，土壤

溶液性質(zhì)對重金屬的毒害作用影響也是需要考慮的重要因素。

3.2 水溶性銅毒性閾值主控因子分析

對于小白菜，Mg2+、K+和S顯著地影響著Cu毒性閾值，它們土壤孔隙水中Cu的毒性閾值ECx(10，50)之間的關(guān)系，如圖3所示。由圖3中，可以看出K+與EC50之間有很強(qiáng)的線性相關(guān)，隨著K+濃度的增加，EC50明顯的有上升的趨勢，同樣對于S，EC50也是隨著S濃度的增加而增加。鄭穎璐等[12]在模擬土壤溶液中增加Mg2+濃度時，以總Cu濃度表示的小白菜根伸長的半抑制濃度線性增加2倍。然而，在大部分的水培和水體試驗中，并沒有發(fā)現(xiàn)K+能有效的影響Cu的毒性。即便如此，K+對Cu毒害的緩解作用，用生物配體模型或者靜電毒性模型都是可以解釋，即K+作為一種競爭性的陽離子降低Cu2+在生物配體表面的絡(luò)合或者降低Cu2+在細(xì)胞質(zhì)膜表面的活性的作用[13-15]。除此之外，K+還是最常見的營養(yǎng)元素，是植物生長必需的，它參與作物對硝態(tài)氮的吸收、還原及氮素的代謝過程。本研究中的測試植物-小白菜，它是攝取土壤中鉀較多的作物，研究也表明高濃度的K素能顯著的提高小白菜的產(chǎn)量、改善小白菜品質(zhì)[16-17]。因此，土壤溶液中的K+可能通過提高小白菜的產(chǎn)量而間接的影響Cu的毒性閾值。

圖3 土壤孔隙水中銅對小白菜生長的毒性閾值ECx (x=10, 50) 與溶液中Mg2+、K+和S含量之間的關(guān)系Fig. 3 Relationships between soil solution Mg2+, K+, S and ECx (x=10, 50) of soil soluble Cu in pore water obtained from the bok choy shoot assays

致謝：感謝國家自然科學(xué)基金和公益性(農(nóng)業(yè))行業(yè)科研專項的經(jīng)費資助。感謝澳大利亞聯(lián)邦科工組織土地與水資源部的Cathy Fiebiger和Gillian Cozens的技術(shù)指導(dǎo)。實驗土壤采樣工作由國家長期土壤肥力試驗站及省級土肥所協(xié)助完成，在此表示感謝。

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◆

TheToxicityEffectofSoilSolubleCopperonBokChoyandItsPredictionModel

Zhang Xiaoqing1, 2, Wei Dongpu2, Li Bo2, Li Jumei2, Chen Shibao2, Ma Yibing2, *

1. College of Forestry and Horticulture, Hubei University for Nationalities, Hubei 445000, China2. National Soil Fertility and Fertilizer Effects Long-term Monitoring Network, Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

3 June 2014accepted11 August 2014

The phytotoxicity / bioavailability of copper (Cu) in soil mainly depends on its liable portion in soil solution and the soil solution properties. Determination of the phytotoxicity of soil soluble copper as a function of soil solution properties is helpful to develop soil environmental risk assessment guidance for China. The bioassay of bok choy plant growth was performed in 17 representative Chinese agricultural soils to investigate the phytotoxicity of soluble Cu based on soil pore water and CaCl2extraction in order to develop empirical models for predicting the soluble Cu phytotoxicity. When considering the toxicity thresholds for Cu in soil pore water, it was found that the effective concentrations that caused 10% biomass growth inhibition (EC10) and 50% inhibition (EC50) represented 14.7 to 14.6 fold differences between the maximum and minimum values. Similarly, theEC10andEC50values of Cu extracted by 0.01 mol·L-1CaCl2had 12.7 to 7.7 fold differences, respectively. These results suggested that the toxicity thresholds of soluble Cu were greatly affected by soil solution properties in a wide range of soils. Meanwhile, the relationships were developed between the important soil solution properties (dissolved organic carbon (DOC), pH, electrical conductivity (EC), S, Ca2+, Mg2+, K+and Na+) and the toxicity thresholds for Cu in a wide range of soils, which indicated that the soluble Cu toxicity on bok choy was predicted well by soil solution properties. Moreover, the multiple regression results showed that Mg, K and S in soil pore water were more important factors controlling Cu toxicity. Single S or K was found to explain 34% (EC10) or 26% (EC50) of variance of the toxicity thresholds, respectively. These quantitative relationships between soluble Cu toxicity and soil solution properties can be helpful for soluble Cu toxicity risk assessment of terrestrial environment.

soil; copper; phytotoxicity; bok choy

2014-06-03錄用日期：2014-08-11

1673-5897(2014)4-729-08

： X171.5

： A

馬義兵(1957—)，男，博士，研究員，主要從事土壤中重金屬的形態(tài)，有效性/毒害，及其可預(yù)測性模型研究，土壤重金屬環(huán)境風(fēng)險評價和治理，發(fā)表學(xué)術(shù)論文140多篇，其中英文70多篇。

國家自然科學(xué)基金資助項目(40971262)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè)科研)科研專項項目(200903015)

張曉晴(1984-)，女，博士，研究方向為土壤重金屬形態(tài)和毒性，E-mail: friedchickenlg@126.com

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail：ybma@caas.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20140510005

張曉晴，韋東普，李 波，等. 土壤水溶態(tài)銅對小白菜的毒害效應(yīng)及其預(yù)測模型[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2014, 9(4): 729-736

Zhang X Q, Wei D P, Li B, et al. The toxicity effect of soil soluble copper on bok choy and its prediction model [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(4): 729-736 (in Chinese)