楊 敏， 王翠玲， 侯小改

(河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽 471003)

擬南芥RRP41L蛋白的原核表達(dá)與純化

楊 敏， 王翠玲， 侯小改

(河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽 471003)

采用PCR技術(shù)克隆得到擬南芥類核糖體RNA加工蛋白41(Ribosomal RNA-processing protein 41-LIKE,RRP41L)基因，然后構(gòu)建其原核表達(dá)載體，并對其進(jìn)行誘導(dǎo)和純化，以期獲得較大量的重組蛋白.結(jié)果表明，試驗(yàn)獲得了擬南芥RRP41L基因的全長編碼序列(coding sequence, CDS)(771 bp)，將其與原核表達(dá)載體PGEX4T-1連接構(gòu)建了原核表達(dá)載體PGEX4T-RRP41L，將PGEX4T-RRP41L質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)中，在37 ℃條件下，用1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)8 h后體外純化融合蛋白.SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，在此誘導(dǎo)條件下，PGEX4T-RRP41L重組質(zhì)?？杀磉_(dá)出較大量的重組蛋白，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小為53.4 kD，除去PGEX4T-1自身表達(dá)相對分子質(zhì)量大小為26.0 kD后，與RRP41L編碼的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量約為27.4 kD的大小一致.

擬南芥；類核糖體RNA加工蛋白41;原核表達(dá)；蛋白純化

在真核細(xì)胞中，存在著大量的內(nèi)切和外切核糖核酸酶參與mRNA的降解過程.外切酶主要包括5′-3′ 核酸外切酶和3′-5′ 核酸外切酶，5′-3′ 核酸外切酶以XRN蛋白家族為代表，廣泛存在與酵母、動物及植物中，且研究也較為深入[1～6].而3′-5′ 核酸外切酶所進(jìn)行的3′-5′ 方向的降解是真核生物中mRNA的主要降解途徑，依賴于一種稱為外切體 (exosome) 的復(fù)合物[7～9].該復(fù)合體廣泛參與了大量RNA的加工、處理及降解過程，包括mRNA，rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA等，且部分亞基的功能已在酵母和動物中得到了較為深入的研究，但是在植物中的研究還很少，所以對于植物核酸外切體組分的研究至關(guān)重要.在擬南芥中，類核糖體RNA加工蛋白41(Ribosomal RNA-processing protein 41-LIKE, RRP41L)基因編碼一個含有256個氨基酸的蛋白質(zhì)，是推測的具有RNase PH域的3′-5′ 核酸外切酶，是一個可能的核酸外切體組分[10,11].本試驗(yàn)前期工作中，通過對rrp41l突變體的表型分析，確定了RRP41L突變對擬南芥早期生長發(fā)育的影響，從生理及分子水平上證明了RRP41L參與了擬南芥種子的萌發(fā)和早期生長發(fā)育過程，并且找到了RRP41L的耙mRNA，闡明了RRP41L是通過影響編碼擬南芥種子儲藏蛋白(seed storage proteins, SSPs)[12～14]及脫落酸(abscisic acid, ABA)[15～17]信號和合成途徑中相關(guān)蛋白mRNA的降解來調(diào)控?cái)M南芥種子的萌發(fā)和早期生長發(fā)育的[18].為了對RRP41L蛋白進(jìn)行更深入的功能探索，本研究通過原核表達(dá)載體的構(gòu)建，誘導(dǎo)表達(dá)蛋白并進(jìn)行純化，旨在獲得較純的目的蛋白，以用于后續(xù)RRP41L蛋白抗體的制備、RRP41L互作蛋白的篩選等生化試驗(yàn)，為進(jìn)一步了解RRP41L的蛋白功能奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)中所使用的植物材料是擬南芥(Arabidopsisthaliana).野生型 (WT) 擬南芥是Columbia (Col-0) 生態(tài)型，為河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存材料.培養(yǎng)條件為：16 h光照/8 h黑暗，溫度是19～22 ℃，相對濕度為50%～70%，光照度為60～100 μmol·m-2·S-1.

1.2擬南芥總RNA的提取及cDNA合成

以5～7 d的擬南芥幼苗為材料，利用Trizol法(Trizol試劑，北京天根生化科技有限公司)，提取總RNA，電泳跑膠，檢測.使用Prim Script RT Reagent Kit (TaKaRa, 大連)合成cDNA第1條鏈.

1.3RRP41L基因CDS的PCR克隆

以1.2的cDNA為模板，根據(jù)擬南芥網(wǎng)站(TAIR)報道的擬南芥RRP41L(At4g27490)的CDS序列設(shè)計(jì)引物，上游引入BamH I (TaKaRa, 大連)位點(diǎn)，下游引入EcoRI (TaKaRa, 大連)位點(diǎn).具體引物為：RRP41L-LP: 5-GGATCC- ATGGCAGCTAAACCTGGAGCCGCAACRRP41L-RP: 5-GAATTC-TCATTCATCGGAAGCTGAGGCAGACTG，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，60 ℃，30 s，72 ℃，1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min.擴(kuò)增結(jié)束后，電泳，跑膠，回收，將回收產(chǎn)物與中間載體pMD-19Tsimple連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂板，選取陽性單克隆菌落，提取質(zhì)粒測序(華大基因公司).

1.4原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將1.3重組質(zhì)粒與表達(dá)質(zhì)粒pGEX 4T-1分別用BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用T4連接酶(TaKaRa, 大連)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli(DH5α)感受態(tài)細(xì)胞(北京天根生化科技有限公司)，涂板，選取陽性單克隆菌落，提取質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，將重組質(zhì)粒命名為PGEX4T-RRP41L.

1.5目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒PGEX4T-RRP41L和空質(zhì)粒PGEX4T-1分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli) BL21(DE3)，挑取陽性克隆接入20 mL含有的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r·min-1振蕩過夜培養(yǎng)，次日以1∶50的比例轉(zhuǎn)接到1 L含有氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)至菌液在600 nm波長處的吸光值大小為0.5～0.8時，取1 mL菌液作為誘導(dǎo)前對照，剩余菌液中加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG(Merck，德國)，37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h，將菌液分裝至50 mL離心管中，4 ℃，4 000 r·min-1離心10 min收集菌體.用預(yù)冷的Buffer L(配方為：50 mmol·L-1Tris-HCl (pH 8.0)，250 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA (pH 8.0)，調(diào)pH 7.5)重懸菌體，加入終濃度為1 mmol·L-1的PMSF(Merck，德國)，充分混勻.冰浴，超聲破碎細(xì)胞(300 W)，每次超聲5 s，間歇10 s，總共30次.細(xì)胞破碎完成后，4 ℃，12 000 r·min-1離心30 min，取上清液與已用Buffer L平衡好的GST親和樹脂填料(Glutathione-SepHarose 4B) (Amersham，美國) 懸液混合，于4 ℃溫和混勻結(jié)合1.5 h，上柱，待瓊脂糖填料沉淀后，讓菌液全部流出.用預(yù)冷的Buffer L充分清洗柱填料至檢測不到蛋白質(zhì).加入預(yù)冷的10 mmol·L-1的還原型谷胱甘肽溶液，將柱子封閉，靜置5 min后打開柱子，讓洗脫液流出，同時用蛋白檢測液檢測，當(dāng)有目標(biāo)蛋白質(zhì)流出時，將目的蛋白質(zhì)根據(jù)試驗(yàn)要求透析到相應(yīng)的工作緩沖液中，收集蛋白質(zhì)，用SDS-PAGE檢測純度，考馬斯亮藍(lán)法檢測濃度，分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆?

2 結(jié)果與分析

2.1擬南芥幼苗中RRP41L全長編碼序列(codingsequences,CDS)的克隆

取約1周齡的擬南芥幼苗，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板，以RRP41L-LP，RRP41L-RP為引物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳跑膠，結(jié)果如圖1所示，獲得了一個大小約為750 bp的片段，片段大小與擬南芥網(wǎng)上的RRP41L基因CDS(771 bp)大小相符，初步確定為目的片段.

M,D 2000.圖1 RRP41L基因CDS片段的克隆Fig.1 Cloning of RRP41L CDS

2.2RRP41LCDS目的片段的獲得

將獲得的PCR產(chǎn)物用天根公司的DNA凝膠回收純化試劑盒回收產(chǎn)物，與中間載體pMD-19T simple連接過夜，之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，積菌，涂布與帶有氨芐青霉素抗性的LB選擇性培養(yǎng)基上，約12 h后，挑取①～⑩號單菌落，進(jìn)行菌落PCR，如圖2-A所示.在陽性菌中選擇2～3個單菌落，搖菌，提取質(zhì)粒，送生物公司測序，用DNAMAN軟件將測序結(jié)果與擬南芥網(wǎng)上的RRP41LCDS片段比對，結(jié)果顯示，獲得的目的片段是完全正確的，可用于后續(xù)試驗(yàn).同時將獲得的2個陽性質(zhì)粒(RRP41L-19T)用BamH I/EcoR I雙酶切，進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖2-B所示.膠圖上方為酶切后的pMD-19 Tsimple，下方顯示的是目的片段.

2.3PGEX4T-RRP41L質(zhì)粒的構(gòu)建

將RRP41L-19T質(zhì)粒雙酶切，之后將目的片段回收，與同樣雙切回收的pGEX4T-1連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，同樣用帶有 Amp抗性的LB選擇性培養(yǎng)基篩選，菌落PCR獲得陽性菌，如圖3-A所示.選取其中2個陽性單菌落搖菌，提取質(zhì)粒，利用BamH I/EcoRI雙酶切鑒定陽性質(zhì)粒，電泳跑膠，結(jié)果如圖3-B所示.上方為雙酶切后的pGEX4T-1，下方為目的片段.將該質(zhì)粒命名為PGEX4T-RRP41L，用于后續(xù)試驗(yàn).

2.4GST-RRP41L重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將陽性質(zhì)粒PGEX4T-RRP41L轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DE3宿主菌中，進(jìn)行菌落PCR，獲得陽性菌，選取2個陽性單菌落用1 mmol·L-1IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，然后集菌做菌的全蛋白電泳檢測.同時也將PGEX4T-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DE3宿主菌中作為對照,結(jié)果如圖4-A所示.融合蛋白GST-RRP41L及GST蛋白都誘導(dǎo)表達(dá)成功，相對分子質(zhì)量均與預(yù)期相符：GST-RRP41L蛋白相對分子質(zhì)量大小為53.4 kD，除去PGEX4T-1自身表達(dá)的26.0 kD蛋白后，與RRP41L編碼的相對分子質(zhì)量約為27.4 kD蛋白的大小一致.

A. ①～⑩號單菌落的菌落PCR結(jié)果；B. 2個陽性質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果; M, 2000.

A. ①～⑩號單菌落的菌落PCR結(jié)果；B. 兩個陽性質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果; M, D5000.

將已檢測的陽性菌接入1 L的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，測定菌液在600 nm波長處的吸光值，大小在0.5～0.8時，加入1 mmol·L-1IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)8 h，集菌，裂解，取上清液與Glutathione-SepHarose 4B瓊脂糖填料結(jié)合，并進(jìn)行融合蛋白的純化.重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖4-B所示，在相應(yīng)的相對分子質(zhì)量位置檢測到了GST-RRP41L重組蛋白質(zhì)的存在，且獲得的重組目的蛋白質(zhì)較純，量也較大.可以用于后續(xù)試驗(yàn).

A.GST,GST-RRP41的誘導(dǎo)表達(dá).1為空載體未加IPTG誘導(dǎo)結(jié)果；2為空載體加1 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果；3，5分別為重組質(zhì)粒①，②號菌未加IPTG誘導(dǎo)結(jié)果； 4，6為重組質(zhì)粒①，②加1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果.B.GST,GST-RRP41L的純化. M, marker.

3 討論

在擬南芥中，RRP41L編碼一個含有256個氨基酸的3′-5′ 核酸外切酶，包含一個在進(jìn)化上十分保守的RNase PH域，是擬南芥一個可能的核酸外切體組分.作者前期的研究結(jié)果表明，RRP41L作為一個可能的核酸外切體亞基，對擬南芥種子的萌發(fā)及早期生長至關(guān)重要，RRP41L的亞細(xì)胞定位結(jié)果也與核酸外切體的定位相一致[18]，進(jìn)一步說明RRP41L是擬南芥核酸外切體的一個重要組分，但是對于該亞基的詳細(xì)作用機(jī)制還不是很清楚，需要進(jìn)一步研究.

外切體廣泛存在于真核生物中，在動物及酵母中的研究較為深入，但是，在植物中的研究還很少.在已有的研究中，發(fā)現(xiàn)真核生物核酸外切體在結(jié)構(gòu)上雖然十分相似，但是在蛋白功能上，尤其是作用機(jī)制方面有明顯的差異.例如，在酵母和人中，外切體的6個含有RNase PH域的亞基是沒有催化活性的[19,20].但是，在果蠅中有報道認(rèn)為，外切體的單個亞基可以單獨(dú)或是2個亞基形成子復(fù)合物發(fā)揮特定的功能[21].而在擬南芥中，已報道RRP41單個亞基是有催化活性的[22].結(jié)合這些研究結(jié)果認(rèn)為，將核酸外切體各亞基組分分離出來，對單個亞基蛋白進(jìn)行詳細(xì)研究，包括蛋白亞基的互作蛋白、作用機(jī)制等，將為深入解析植物核酸外切體功能，了解真核生物外切體差異提供重要試驗(yàn)證據(jù).特別是近年來，對擬南芥核酸外切體的研究僅僅局限于對各亞基缺失突變體的表型分析及亞基底物RNA的尋找，而對于其詳細(xì)的作用機(jī)制并沒有深入探討.

為了填補(bǔ)這方面的研究空白，并解決“擬南芥RRP41L蛋白與其他蛋白的互作關(guān)系及其詳細(xì)的作用機(jī)制”這一科學(xué)問題，RRP41L蛋白的體外誘導(dǎo)和純化至關(guān)重要.本試驗(yàn)在前期工作的基礎(chǔ)上，首次通過原核表達(dá)載體的構(gòu)建，成功誘導(dǎo)和純化了目的蛋白.在試驗(yàn)中影響大腸桿菌表達(dá)融合蛋白的因素很多，包括誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)IPTG濃度及誘導(dǎo)時間等[23,24].為了高效表達(dá)該蛋白，本試驗(yàn)對GST-RRP41L重組蛋白的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了摸索，通過SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,當(dāng)誘導(dǎo)溫度為37 ℃，IPTG濃度為1 mmol·L-1，誘導(dǎo)時間為8 h時，誘導(dǎo)條件為最佳，能夠獲得較純和較大量的目的蛋白.GST-RRP41L重組蛋白的成功獲得為后續(xù)的研究工作，包括體外互作蛋白篩選試驗(yàn)、蛋白抗體的制備等生化試驗(yàn)提供了材料，為深入研究擬南芥RRP41L蛋白的功能打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ).

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(責(zé)任編輯：常思敏)

ProkaryoticexpressionandpurificationofRRP41LinArabidopsisthaliana

YANG Min, WANG Cui-ling, HOU Xiao-gai
(College of Agronomy, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

In order to construct prokaryotic expression vector and to obtain the recombinant gene expression in the host bacteria, we cloned full-length coding sequence (CDS) of Ribosomal RNA-processing Protein 41-LIKE (RRP41L) inArabidopsisby the PCR method followed by restriction enzymes cutting and connection. The results of the experiments showed: the full-length of RRP41L CDS (771bp) was cloned, fused with the vector of PGEX4T-1, and a recombinant of prokaryotic expression vector (PGEX4T-RRP41L) was constructed successfully. Then the expression plasmid PGEX4T-RRP41L was transformed toE.coliBL21 (DE3). RRP41L protein expressed effectively after being induced for 8 hours with 1 mmol·L-1IPTG at 37 ℃. The SDS-PAGE results indicated that the fusion protein was expressed with molecular weight of 53.4 kD, with the PGEX4T-1 own induction produced 26.0 kD protein. The result was consistent with the 27.4 kD protein which encoded byRRP41L.

Arabidopsis;RRP41L; prokaryotic expression; purification

1000-2340(2014)06-0731-05

Q 202

：A

2014-08-24

國家青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31101153)

楊 敏，1985年生，女，山東棗莊人，副教授，博士，主要從事植物發(fā)育分子生物學(xué)方面的研究.