孫芳芳，羅楠楠，李俊強，趙金鳳，李廷文，黃建營，張龍現(xiàn)

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省人獸共患病國際聯(lián)合實驗室，河南 鄭州 450002)

水果及蔬菜表面環(huán)孢子蟲卵囊檢測方法的建立

孫芳芳1,2，羅楠楠1,2，李俊強1,2，趙金鳳1，李廷文1,2，黃建營1,2，張龍現(xiàn)1,2

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省人獸共患病國際聯(lián)合實驗室，河南 鄭州 450002)

為了建立檢測果蔬表面人源卡耶坦環(huán)孢子蟲(Cyclosporacayetanensis)卵囊的方法,分別用 50，500 個環(huán)孢子蟲卵囊對環(huán)孢子蟲卵囊陰性的新鮮果蔬進(jìn)行人工污染，并設(shè)置陰性對照；使用含有0.1% Alconox?，0.1% 雕牌，0.1% 立白、0.1% 白貓的4種洗滌液和去離子水，在搖床中洗脫樣品；然后，反復(fù)離心 3 次收集卵囊并提取卵囊DNA；最后，基于環(huán)孢子蟲18S rRNA基因位點對卵囊DNA樣品進(jìn)行巢式 PCR 擴增.結(jié)果表明,卵囊污染吸附最佳時間為24 h，樣品洗脫最佳時間為30 min.其中，只用去離子水時，生菜、西葫蘆、黃瓜、西瓜、甜瓜和草莓的檢測敏感性可達(dá)到 50個卵囊，而西紅柿可達(dá)到 500個卵囊；當(dāng)用不同洗滌劑時，各樣品的檢測敏感性均可達(dá)到 50 個卵囊.不同洗滌劑之間檢測敏感性無顯著差異.該研究初步建立檢測水果、蔬菜污染環(huán)孢子蟲卵囊的技術(shù)，采用此方法可特異、敏感、快速的檢測果蔬表面環(huán)孢子蟲卵囊，為食源性環(huán)孢子蟲病暴發(fā)溯源提供技術(shù)支持.

環(huán)孢子蟲卵囊；18S rRNA；檢測敏感性；巢式PCR

卡耶坦環(huán)孢子蟲(Cyclosporacayetanensis)是一種新發(fā)現(xiàn)的人體腸道原蟲，對免疫功能正常者可引起自限性腹瀉，免疫抑制者或免疫功能缺陷者則可引起持續(xù)性腹瀉甚至死亡[1～3].在發(fā)達(dá)國家，環(huán)孢子蟲是引起大多數(shù)暴發(fā)性腹瀉病的主要病原，多是通過發(fā)展中國家被污染的新鮮農(nóng)產(chǎn)品傳入，或由旅游者攜帶傳播[4,5].在發(fā)展中國家，環(huán)孢子蟲感染大多是本土性的，偶爾是伴發(fā)性[6].已報道與環(huán)孢子蟲病暴發(fā)有關(guān)的食物有木莓、草莓、萵苣、羅勒和色拉等[7～9].另外，土壤中也存在環(huán)孢子蟲，也有報道環(huán)孢子蟲可經(jīng)水源傳播[10～12]，感染多發(fā)生在熱帶或亞熱帶地區(qū)，其感染情況隨季節(jié)而改變，環(huán)孢子蟲在夏季最為流行[13,14].2013年美國25個州暴發(fā)環(huán)孢子蟲病，發(fā)現(xiàn)643個病例，可能與食用沙拉有相關(guān)性[15].中國的鄭州和開封每年均發(fā)現(xiàn)有陽性病人，但其感染來源尚不清楚[16].由于環(huán)孢子蟲病多發(fā)生于溫暖濕潤的雨季[14,17]，且多與水果、蔬菜有關(guān)[11,18]，推測患者感染環(huán)孢子蟲與生食夏秋季節(jié)新鮮果蔬有一定關(guān)系.本試驗選擇7種夏季常見果蔬為研究對象，基于環(huán)孢子蟲18S rRNA 基因的巢式PCR方法來檢測果蔬表面的環(huán)孢子蟲卵囊，為環(huán)孢子蟲病的暴發(fā)溯源和流行傳播提供技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 環(huán)孢子蟲卵囊 卡耶坦環(huán)孢子蟲卵囊由河南省人獸共患病國際聯(lián)合實驗室保存.2012年采集開封市淮河醫(yī)院1名腹瀉患者糞便樣品，顯微鏡檢查環(huán)孢子蟲卵囊OPG值(克糞便卵囊值)達(dá)到 3.2×104，基于18S rRNA基因的序列分析確診為環(huán)孢子蟲，用蔗糖梯度離心法對獲得的糞便樣品進(jìn)行純化[19]，置于 2.5% 重鉻酸鉀溶液中4 ℃保存.

1.1.2 蔬菜及水果 從超市購買新鮮的生菜、西葫蘆、黃瓜、西瓜、甜瓜、草莓和西紅柿.

1.1.3 洗滌劑 本試驗選擇了4種洗滌劑，分別為Alconox?洗潔精、立白洗潔精、雕牌洗潔精和白貓洗潔精(使用時各洗滌劑均用去離子水稀釋至0.1%)，Alconox?洗潔精由美國Alconox公司生產(chǎn)，有效成分是去電荷離子；立白洗潔精由立白集團生產(chǎn)，有效成分是十二烷基苯磺酸鈉等；雕牌洗潔精由納愛斯集團生產(chǎn)，有效成分是高效復(fù)合活性劑，APG (烷基糖苷)；白貓洗潔精由白貓集團生產(chǎn)，有效成分是表面活性劑.

1.1.4 主要儀器和設(shè)備 BagPage?+400 mL過濾袋，法國INTERSCIENCE公司；氣浴恒溫振蕩器，江蘇金壇市億通電子有限公司；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京六一儀器廠；P×2 Thermal Cycler PCR儀，美國Applied Biosystems公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，英國Syngene公司；微量加樣器，德國Brand公司；SP-DT系列水平凈化工作臺，上海浦東偉普凈化設(shè)備廠；低速大容量離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司等.

1.2方法

1.2.1 蔬菜及水果的清洗 將從超市購買的生菜、草莓和西紅柿樣品用自來水沖洗5 min.室溫下放置2 h晾干樣品.將西葫蘆、黃瓜、西瓜和甜瓜用水果刀削皮，將表皮用自來水沖洗5 min，室溫下放置2 h晾干.

1.2.2 卵囊計數(shù) 分別取5 μL純化后的環(huán)孢子蟲卵囊液和10 μL 50%甘油水滴加于潔凈載玻片上[20]，混勻后加蓋玻片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察計數(shù)，反復(fù)進(jìn)行5次，其平均數(shù)即為環(huán)孢子蟲卵囊原液的濃度(個·mL-1).

1.2.3 人工污染卵囊 本試驗參照STEELE等[21]和JOAN等[22]建立的方法及其研究結(jié)果，選擇了50，500個環(huán)孢子蟲卵囊進(jìn)行試驗.以去離子水作為稀釋液，將環(huán)孢子蟲卵囊液分別稀釋至每100 μL含卵囊量為50個和500個.具體操作如下：稱取相同質(zhì)量晾干的生菜樣品3份，(或者相同質(zhì)量西葫蘆、西瓜、黃瓜、甜瓜、草莓和西紅柿各3份)，用加樣器將稀釋好的不同濃度環(huán)孢子蟲卵囊液均勻人工污染到每份樣品上[21]，第3份樣品設(shè)置為陰性對照；在4 ℃下放置24 h，使卵囊完全吸附到樣品表面.

1.2.4 洗脫卵囊 用鑷子將樣品移至BagPage?+過濾袋中，加入100 mL洗滌劑，用袋夾密封袋口，放入搖床振蕩洗脫[23, 24]，將濾液平均分裝到2個50 mL的離心管中；再加入100 mL去離子水沖洗 BagPage?+過濾袋，將濾液分裝到2個50 mL的離心管中；將濾液以3 000 r·min-1離心10 min；反復(fù)離心沉淀3次，收集沉淀到2 mL的離心管中，置于4 ℃冰箱中保存.

1.2.5 比較不同質(zhì)量樣品洗脫效果 參照PALMER等[24]試驗中樣品的用量，稱取25 g或15 g生菜樣品各3份(或者25 g或15 g西葫蘆、黃瓜、西瓜和甜瓜樣品各3份，50 g草莓樣品3份，100 g西紅柿樣品3份)，用加樣器將稀釋好的不同濃度環(huán)孢子蟲卵囊液均勻人工污染到樣品上[23]，分別人工污染50個和500個卵囊，并設(shè)置1個陰性對照.卵囊人工污染果蔬吸附時間為24 h，搖床振蕩洗脫30 min，收集卵囊后進(jìn)行PCR擴增.

1.2.6 比較不同洗脫時間樣品洗脫效果 選取洗脫效果好的樣品質(zhì)量，樣品吸附卵囊時間為24 h，袋夾密封袋口，參照文獻(xiàn)[21,24]的樣品洗脫時間，將樣品放入搖床振蕩30 min(或者20 min)進(jìn)行洗脫，收集卵囊后進(jìn)行PCR擴增.

1.2.7 比較不同洗滌劑對各樣品的洗脫效果 參照J(rèn)OAN等[23]的方法，選擇國內(nèi)市場上常用的3種洗潔精和Alconox?洗潔精，分別取100 μL的洗潔精，加入到100 mL的去離子水中，配成濃度為0.1% 的洗滌劑.取洗脫效果好的樣品質(zhì)量及洗脫時間，樣品吸附卵囊時間為24 h，把樣品移至 BagPage?+過濾袋中，加入100 mL去離子水(或者100 mL 0.1%的Alconox?洗潔精、0.1%的立白洗潔精、0.1%的雕牌洗潔精、0.1%的白貓洗潔精)，收集卵囊后進(jìn)行PCR擴增.

1.2.8 比較卵囊吸附不同時間時各樣品洗脫效果 取洗脫效果好的樣品質(zhì)量及洗脫時間，使用0.1%的Alconox?洗潔精，參照J(rèn)OAN等[21]和STEELE等[23]試驗中樣品吸附卵囊的時間，將人工污染卵囊后的樣品在4 ℃下放置24 h(或者12 h)，收集卵囊后進(jìn)行PCR擴增.

1.2.9 樣品DNA提取 樣品 DNA 提取采用美國OMEGA Bio-Tek公司生產(chǎn)的 Stool DNA Kit試劑盒(D4015-02)，根據(jù)說明書步驟進(jìn)行，提取后的 DNA 置于-20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.10 PCR擴增 參照肖淑敏等[25]設(shè)計的引物，擴增長度為501 bp的環(huán)孢子蟲18S rRNA基因片段，引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成.引物序列見表1.

反應(yīng)體系：第 1 次 PCR 反應(yīng)：在25 μL的反應(yīng)體系中加入模板 DNA 1 μL，50 μmol·L-1引物各0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 2.5 μL，KOD-plus 酶0.5 μL，Mg2+1.5 μL，加滅菌雙蒸水到25 μL.第2次PCR反應(yīng)：在25 μL的反應(yīng)體系中加入第1次反應(yīng)產(chǎn)物 1 μL作為模板，50 μmol·L-1引物各 0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 2.5 μL，kOD-plus 酶0.5 μL，Mg2+1.5 μL，加滅菌雙蒸水到 25 μL.

表1 環(huán)孢子蟲18S rRNA基因巢式PCR引物Table 1 Nested PCR primers of Cyclospora 18S rRNA gene

反應(yīng)步驟：第 1 次反應(yīng)和第2次反應(yīng)均為：預(yù)變性 94 ℃，7 min；然后 35 個循環(huán)：(94 ℃，30 s；55 ℃，30 s：72 ℃，90 s)；最后延伸72 ℃，7 min.

1.2.11 PCR擴增靈敏性和特異性試驗 取100 μL含環(huán)孢子蟲卵囊量為分別為10，20，40，60，80，100，200，300，400，500個的卵囊液，進(jìn)行 DNA 提取，以雙蒸水為陰性對照，基于本試驗中選用的18S rRNA基因引物進(jìn)行擴增，然后進(jìn)行凝膠電泳，對出現(xiàn)目的條帶的樣品進(jìn)行測序，并對所測序列結(jié)果進(jìn)行 Blast 搜索和序列比對.

微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)，腸賈第蟲(Giardiaintestinalis)，羊無漿體(Anaplasmaovis)，環(huán)形泰勒蟲(Theileriaannulata)，豬帶絳蟲(Taeniasolium)，豬流感病毒(Swineinfluenzavirous)的陽性 DNA 均由本實驗室提供，沙門氏菌(Salmonella)，大腸桿菌(Escherichiacoli)，新城疫病毒(Newcastle Disease Virus)的陽性 DNA 由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)實驗室提供，基于本試驗中選用的 18S rRNA 基因引物進(jìn)行擴增，然后進(jìn)行凝膠電泳.

2 結(jié)果與分析

2.1PCR擴增靈敏性和特異性

10個樣本均出現(xiàn) 500 bp左右的擴增條帶，PCR產(chǎn)物均與設(shè)計的目的片段大小相符，未出現(xiàn)非特異性條帶.對所測序列結(jié)果進(jìn)行Blast搜索和序列比對，與卡耶坦環(huán)孢子蟲同源性為100%.PCR擴增結(jié)果如圖1所示.

基于本試驗中選用的 18S rRNA 基因引物進(jìn)行擴增，對Cryptosporidiumparvum，Giardiaintestinalis，Anaplasmaovis，Theileriaannulata，Taeniasolium，Swine influenza，Salmonella，Escherichiacoli，Newcastle Disease Virus的陽性 DNA 進(jìn)行PCR擴增的結(jié)果如圖2所示.

M.DL2000分子標(biāo)記；P.陽性對照；1～10.卵囊量為10，20，40，60，80，100，200，300，400，500個的PCR擴增結(jié)果；N.陰性對照.

M.DL2000分子標(biāo)記；C.卡耶坦環(huán)孢子蟲；1.微小隱孢子蟲；2.腸賈第蟲:3.綿羊無漿體:4.環(huán)形泰勒蟲；5.大腸桿菌；6.沙門氏菌；7.豬帶絳蟲；8.豬流感病毒；9.新城疫病毒； N.陰性對照.

2.2不同質(zhì)量果蔬檢測情況

人工污染 500 個卵囊，不同質(zhì)量的樣品均出現(xiàn)目的條帶，且結(jié)果穩(wěn)定；人工污染 50 個卵囊，生菜、西葫蘆、西瓜、黃瓜和甜瓜樣品25 g，3次 PCR 擴增結(jié)果不穩(wěn)定，草莓 50 g，出現(xiàn)目的條帶；西紅柿100 g，未出現(xiàn)目的條帶.生菜、西葫蘆、西瓜、黃瓜和甜瓜為15 g，3次 PCR 擴增均能出現(xiàn)目的條帶(圖 3 , 圖4 ).

2.3不同洗脫時間檢測情況人工污染卵囊數(shù)量為500個洗脫時間為30 min和20 min 時，各樣品3次PCR擴增均能出現(xiàn)目的條帶.人工污染卵囊數(shù)量為50個，洗脫時間為20 min時，生菜、西葫蘆、西瓜、黃瓜、甜瓜和草莓3次PCR擴增結(jié)果不穩(wěn)定，西紅柿未出現(xiàn)目的條帶；人工污染卵囊數(shù)量為50個，洗脫時間為30 min時，生菜、西葫蘆、西瓜、黃瓜、甜瓜和草莓3次PCR擴增均能出現(xiàn)目的條帶，西紅柿未出現(xiàn)目的條帶(圖5和圖6).

M.DL2000分子標(biāo)記；P.陽性對照；1.生菜，0個；2.生菜，50個；3.生菜，500個；4.西葫蘆，0個；5.西葫蘆，50個；6.西葫蘆，500個；7.黃瓜，0個；8.黃瓜，50個；9.黃瓜，500個；10.西瓜，0個；11.西瓜，50個；12.西瓜，500個；13.甜瓜，0個；14.甜瓜，50個；15.甜瓜，500個；16.草莓，0個；17.草莓，50個；18.草莓，500個；19.西紅柿.0個；20.西紅柿.50個；21.西紅柿.500個；N.陰性對照.

M.DL2000分子標(biāo)記；P.陽性對照；1.生菜，0個；2.生菜，50個；3.生菜，500個；4.西葫蘆，0個；4.西葫蘆，50個；6.西葫蘆，500個；7.黃瓜，0個；8.黃瓜，50個；9.黃瓜，500個；10.西瓜，0個；11.西瓜，50個；12.西瓜，500個；13.甜瓜，0個；14.甜瓜，50個；15.甜瓜，500個；16.草莓，0個；17.草莓，50個；18.草莓，500個；19.西紅柿.0個；20.西紅柿.50個；21.西紅柿.500個；N.陰性對照.

M.DL2000分子標(biāo)記；P.陽性對照；1.生菜，0個；2.生菜，50個；3.生菜，500個；4.西葫蘆，0個；5.西葫蘆，50個；6.西葫蘆，500個；7.黃瓜，0個；8.黃瓜，50個；9.黃瓜，500個；10.西瓜，0個；11.西瓜，50個；12.西瓜，500個；13.甜瓜，0個；14.甜瓜，50個；15.甜瓜，500個；16.草莓，0個；17.草莓，50個；18.草莓，500個；19.西紅柿.0個；20.西紅柿.50個；21.西紅柿.500個；N.陰性對照.

M.DL2000分子標(biāo)記；P.陽性對照；1.生菜，0個；2.生菜，50個；3.生菜，500個；4.西葫蘆，0個；5.西葫蘆，50個；6.西葫蘆，500個；7.黃瓜，0個；8.黃瓜，50個；9.黃瓜，500個；10.西瓜，0個；11.西瓜，50個；12.西瓜，500個；13.甜瓜，0個；14.甜瓜，50個；15.甜瓜，500個；16.草莓，0個；17.草莓，50個；18.草莓，500個；19.西紅柿.0個；20.西紅柿.50個；21.西紅柿.500個；N.陰性對照.

2.4不同洗滌劑的洗脫效果比較

使用不同洗滌劑成分，檢測各種水果、蔬菜表面環(huán)孢子蟲卵囊的洗脫效果.當(dāng)使用 0.1% 的Alconox?洗潔精、0.1% 的立白洗潔精、0.1% 的雕牌洗潔精、0.1% 的白貓洗潔精時，進(jìn)行3次平行試驗，生菜、西葫蘆、黃瓜、西瓜、甜瓜、草莓和西紅柿的檢測敏感性均可達(dá)到50 個(圖7～圖10)

M.DL2000分子標(biāo)記；P.陽性對照；1.生菜，0個；2.生菜，50個；3.生菜，500個；4.西葫蘆，0個；5.西葫蘆，50個；6.西葫蘆，500個；7.黃瓜，0個；8.黃瓜，50個；9.黃瓜，500個；10.西瓜，0個；11.西瓜，50個；12.西瓜，500個；13.甜瓜，0個；14.甜瓜，50個；15.甜瓜，500個；16.草莓，0個；17.草莓，50個；18.草莓，500個；19.西紅柿.0個；20.西紅柿.50個；21.西紅柿.500個；N.陰性對照.

M.DL2000分子標(biāo)記；P.陽性對照；1.生菜，0個；2.生菜，50個；3.生菜，500個；4.西葫蘆，0個；5.西葫蘆，50個；6.西葫蘆，500個；7.黃瓜，0個；8.黃瓜，50個；9.黃瓜，500個；10.西瓜，0個；11.西瓜，50個；12.西瓜，500個；13.甜瓜，0個；14.甜瓜，50個；15.甜瓜，500個；16.草莓，0個；17.草莓，50個；18.草莓，500個；19.西紅柿.0個；20.西紅柿.50個；21.西紅柿.500個；N.陰性對照.

2.5卵囊吸附時間長短對檢測效果的影響

卵囊分別吸附 12 h和24 h，均用0.1% Alconox?洗潔精，進(jìn)行 3 次平行試驗，各樣品檢測敏感性均能達(dá)到 50 個卵囊(圖 11，圖12 ).

M.DL2000分子標(biāo)記；P.陽性對照；1.生菜，0個；2.生菜，50個；3.生菜，500個；4.西葫蘆，0個；5.西葫蘆，50個；6.西葫蘆，500個；7.黃瓜，0個；8.黃瓜，50個；9.黃瓜，500個；10.西瓜，0個；11.西瓜，50個；12.西瓜，500個；13.甜瓜，0個；14.甜瓜，50個；15.甜瓜，500個；16.草莓，0個；17.草莓，50個；18.草莓，500個；19.西紅柿.0個；20.西紅柿.50個；21.西紅柿.500個；N.陰性對照.

M.DL2000分子標(biāo)記；P.陽性對照；1.生菜，0個；2.生菜，50個；3.生菜，500個；4.西葫蘆，0個；5.西葫蘆，50個；6.西葫蘆，500個；7.黃瓜，0個；8.黃瓜，50個；9.黃瓜，500個；10.西瓜，0個；11.西瓜，50個；12.西瓜，500個；13.甜瓜，0個；14.甜瓜，50個；15.甜瓜，500個；16.草莓，0個；17.草莓，50個；18.草莓，500個；19.西紅柿.0個；20.西紅柿.50個；21.西紅柿.500個；N.陰性對照.

3 小結(jié)與討論

M.DL2000分子標(biāo)記；P.陽性對照；1.生菜，0個；2.生菜，50個；3.生菜，500個；4.西葫蘆，0個；5.西葫蘆，50個；6.西葫蘆，500個；7.黃瓜，0個；8.黃瓜，50個；9.黃瓜，500個；10.西瓜，0個；11.西瓜，50個；12.西瓜，500個；13.甜瓜，0個；14.甜瓜，50個；15.甜瓜，500個；16.草莓，0個；17.草莓，50個；18.草莓，500個；19.西紅柿.0個；20.西紅柿.50個；21.西紅柿.500個；N.陰性對照.

M.DL2000分子標(biāo)記；P.陽性對照；1.生菜，0個；2.生菜，50個；3.生菜，500個；4.西葫蘆，0個；5.西葫蘆，50個；6.西葫蘆，500個；7.黃瓜，0個；8.黃瓜，50個；9.黃瓜，500個；10.西瓜，0個；11.西瓜，50個；12.西瓜，500個；13.甜瓜，0個；14.甜瓜，50個；15.甜瓜，500個；16.草莓，0個；17.草莓，50個；18.草莓，500個；19.西紅柿.0個；20.西紅柿.50個；21.西紅柿.500個；N.陰性對照.

在世界范圍內(nèi)，由于食用水果、蔬菜而感染環(huán)孢子蟲的病例不斷有報道.在1995—2001 年，在美國的各大州相繼有關(guān)于環(huán)孢子蟲病暴發(fā)的報道，與羅勒、生菜、蘋果沙拉和雞肉沙拉有關(guān)[26]，2013年6月至8月美國25個州暴發(fā)環(huán)孢子蟲病，發(fā)現(xiàn)643個病例，已查明與產(chǎn)自“泰勒農(nóng)場”墨西哥分公司的受污染袋裝沙拉有關(guān),包括卷心生菜、葉生菜、紫甘藍(lán)及胡蘿卜[15]，MILORD等[5]對加拿大250名有胃腸炎癥狀的工人進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)了環(huán)孢子蟲卵囊的存在，這些人都食用過從墨西哥進(jìn)口的羅勒.為了了解水果、蔬菜表面環(huán)孢子蟲卵囊的污染情況，國外學(xué)者已經(jīng)建立了水果、蔬菜表面環(huán)孢子蟲卵囊的檢測方法，STEELE等[21]使用無菌去離子水對樹莓、羅勒和萵苣進(jìn)行洗滌，對樹莓和羅勒的檢測靈敏度可以達(dá)到40個·100 g-1，甚至更少，對萵苣的檢測靈敏度只能達(dá)到 1 000個·100 g-1.SHIELDS 等[22, 23]對 dH2O，PBS和Alconox?洗潔精等不同的洗滌劑洗滌效果進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Alconox?洗潔精的效果最好，對羅勒表面環(huán)孢子蟲卵囊的回收率最高可達(dá)到 90.1% 以上，對生菜葉子上環(huán)孢子蟲卵囊的回收率最高可以達(dá)到80.6%.PALMER等[24]建立的方法，在洗滌劑中添加了NET-BSA緩沖液和PVPP，pH值為5.5.本研究結(jié)果表明，當(dāng)生菜、西葫蘆、西瓜、黃瓜和甜瓜樣品的質(zhì)量為25 g時，檢測敏感性不能達(dá)到50個，當(dāng)減少這幾種樣品的質(zhì)量為15 g時，檢測敏感性能達(dá)到50個.分析這種結(jié)果的原因可能是過濾袋的空間有限，樣品表面積不宜過大，過大會導(dǎo)致洗脫不充分.只用去離子水時，西紅柿的檢測敏感性不能達(dá)到50個.分析原因可能是西紅柿表面的縫隙小，卵囊被吸附后不易洗脫，而使用洗滌劑時洗脫效果較好.在對洗脫時間對洗脫效果影響的比較中，選擇了20 min和30 min進(jìn)行對比.研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，洗脫時間為20 min時，進(jìn)行平行試驗的結(jié)果很不穩(wěn)定，洗脫時間為30 min時，平行試驗結(jié)果穩(wěn)定可靠.這就為流行病學(xué)調(diào)查時樣品取量以及樣品洗脫時間提供了穩(wěn)定可靠的依據(jù).STEELE 等[21]等證明，采用不同成分的洗滌劑對吸附在蔬菜、水果表面的環(huán)孢子蟲卵囊進(jìn)行洗脫，0.1% 的Alconox?洗潔精效果最好，因此本實驗選擇了Alconox?洗潔精以及國內(nèi)市場上常用的立白、雕牌和白貓洗潔精進(jìn)行對比，結(jié)果無顯著性差異.考慮到經(jīng)濟效益問題，在進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查時，可選用立白、雕牌和白貓洗潔精的任意一種進(jìn)行試驗.試驗證明樣品吸附卵囊12 h和24 h洗脫結(jié)果沒有顯著性差異，說明當(dāng)卵囊吸附時間為12 h時，樣品已經(jīng)可以完全將卵囊吸附，洗脫結(jié)果是可靠的.

本試驗建立了一種快速、簡便、穩(wěn)定可靠的檢測果蔬表面環(huán)孢子蟲卵囊的方法，其檢測敏感性均可達(dá)到50個，建立此方法可以探討病原傳播的介質(zhì)是哪些食品原料，為進(jìn)一步追溯暴發(fā)來源提供技術(shù)支撐.

[1] NIMRI L F.Cyclosporacayetanensisand other intestinal parasites associated with diarrhea in a rural area of Jordan [J]. Int Microbiol, 2003, 6(2): 131-135.

[2] ORTEGA Y R,ROXAS C R,GILMAN R H, et al. Isolation ofCryptosporidiumparvumandCyclosporacayetanensisfrom vegetables collected in markets of an endemic region in Peru [J].Am J Trop Med Hyg,1997, 57(6): 683-686.

[3] AGHOLI M,HATAM G R,MOTAZEDIAN M H.HIV/AIDS-associated opportunistic protozoal diarrhea [J]. AIDS Res Hum Retroviruses,2013,29(1): 35-41.

[4] MILORD F,LAMPRON-GOULET E, STAMOUR M,et al.Cyclosporacayetanensis: a description of clinical aspects of an outbreak in Quebec, Canada [J]. Epidemiol Infect, 2012, 140(4): 626-632.

[5] RAMIREZ-OLIVENCIA G, HERRERO M D, SUBIRATS M,et al.Cyclosporacayetanensisoutbreak in travelers to Cuba [J].Enferm Infecc Microbiol Clin,2008,26(9):558-560.

[6] BLANS M C,RIDWAN B U,VERWEIJ J J,et al.Cyclosporiasisoutbreak,Indonesia [J].Emerg Infect Dis, 2005, 11(9): 1453-1455.

[7] HERWALDT B L.Cyclosporacayetanensis:a review, focusing on the outbreaks ofcyclosporiasisin the 1990s [J].Clin Infect Dis,2000,31(4):1040-1057.

[8] INSULANDER M, SVENUNGSSON B,LEBBAD, et al.A foodborne outbreak ofCyclosporainfection in Stockholm, Sweden[J].Foodborne Pathog Dis,2010,7(12): 1585-1587.

[9] CHACIN-BONILLA L.Transmission ofCyclosporacayetanensisinfection:a review focusing on soil-bornecyclosporiasis[J].Trans R Soc Trop Med Hyg,2008,102(3):215-216.

[10] LOPEZ A S,DODSON D R,ARROWOOD M J,et al.Outbreak ofcyclosporiasisassociated with basil in Missouri in 1999[J]. Clin Infect Dis,2001,32(7):1010-1017.

[11] HO A Y,LOPEZ A S,EBERHART M G,et al.Outbreak ofcyclosporiasisassociated with imported raspberries,Philadelphia,Pennsylvania, 2000[J].Emerg Infect Dis,2002,8(8):783-788.

[12] ORTEGA Y R,SANCHEZ R. Update onCyclosporacayetanensis,a food-borne and waterborne parasite[J].Clin Microbiol Rev,2010,23(1):218-234.

[13] BERN C,HERNANDEZ B,LOPEZ M B, et al.Epidemiologic studies ofCyclosporacayetanensisin Guatemala [J].Emerg Infect Dis,1999,5(6):766-774.

[14] FRYAUFF D J,KRIPPNER R,PRODJODIPURO P,et al.Cyclosporacayetanensisamong expatriate and indigenous populations of West Java,Indonesia [J].Emerging infectious diseases,1999, 5(4):585.

[15]Centers for Disease Control and Prevention(CDC).Outbreaks ofcyclosporiasis-United States, June-August 2013 [J].MMWR Morb Mortal Wkly Rep,2013,62(43):862.

[16] ZHOU Y,LV B,WANG Q, et al.Prevalence and molecular characterization ofCyclosporacayetanensis, Henan, China[J].Emerg Infect Dis,2011,17(10):1887-1890.

[17] KIMURA K,RAI S K,RAI G,et al.Study oncyclosporacayetanensisassociated with diarrheal disease in Nepal and Loa PDR[J].Southeast Asian J Trop Med Public Health,2005,36(6):1371-1376.

[18] HERWALDT B L,ACKERS M L.An outbreak in 1996 ofcyclosporiasisassociated with imported raspberries. The Cyclospora Working Group[J].N Engl J Med,1997,336(22):1548-1556.

[19] 張龍現(xiàn),黃 磊,安春霞,等.隱孢子蟲卵囊純化方法的改進(jìn)研究[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,2010(1):79-80.

[20] 賀桂芬,寧長申,張龍現(xiàn),等.隱孢子蟲卵囊不同計數(shù)方法的比較[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2006(5):102-104.

[21] STEELE M,UNGER S,ODUMERU J,et al.Sensitivity of PCR detection ofCyclosporacayetanensisin raspberries,basil,and mesclun lettuce[J].J Microbiol Methods,2003,54(2):277-280.

[22] SHIELDS J M,JOO J,KIM R, et al.Assessment of three commercial DNA extraction kits and a laboratory-developed method for detectingCryptosporidiumandCyclosporain raspberry wash, basil wash and pesto[J].J Microbiol Methods,2013,92(1):51-58.

[23] SHIELDS J M,LEE M M, MURPHY H R.Use of a common laboratory glassware detergent improves recovery ofCryptosporidiumparvumandCyclosporacayetanensisfrom lettuce, herbs and raspberries[J].Int J Food Microbiol,2012,153(1/2):123-128.

[24] PALMER A,ORLANDI C F L C.Detection ofCyclosporaandCryptosporidiumfrom Fresh Produce: Isolation and Identification by Polymerase Chain Reaction (PCR) and Microscopic analysis[J].Bacteriological Analytical Manual, 2004(19): 1-11.

[25] 肖淑敏,李國清,周榮瓊,等.牛源環(huán)孢子蟲的發(fā)現(xiàn)與分子鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2006, 28(4):380-383.

[26] LOPEZ A S,DODSON D R,ARROWOOD M J,et al.Outbreak ofcyclosporiasisassociated with basil in Missouri in 1999[J].Clin Infect Dis,2001,32(7):1010-1017.

(責(zé)任編輯：蔣國良)

DevelopmentofmethodfordetectingCyclosporaoocystsonthesurfaceoffreshfruitsandvegetables

SUN Fang-fang1,2, LUO Nan-nan1,2, LI Jun-qiang1,2, ZHAO Jin-feng1, LI Ting-wen1,2, HUANG Jian-ying1,2, ZHANG Long-xian1,2
(1.College of Animal Husbandry and Veterinary Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002，China; 2.International Joint Research Laboratory for Zoonotic Disease Henan Province, Zhengzhou 450002, China)

In order to develop a method for detection of humanCyclosporacayetanensison the surface of vegetables and fruits, 50 and 500Cyclosporaoocysts were artificially contaminated to the surface of fruits and vegetables, and a negative control was used. The samples were washed using different kinds of detergent (0.1% Alconox?, 0.1% Liby, 0.1% Diaopai, and 0.1% Baimao) by the gas bath thermostats oscillator, then oocysts were collected after three times centrifuge and DNA was extracted. Finally, the DNA samples were detected by nested PCR amplification of the 18S rRNA gene. The results show that the optimal time for oocysts absorption to substance is 24 hours, and the optimal washing time for samples is 30 minutes. When using 100 mL deionized water, the minimum detectable level of lettuce, zucchini, cucumbers, watermelons, melons and strawberries was 50 oocysts, respectively, but for tomatoes it was 500 oocysts. When using the 4 different kinds of detergent, the minimum detectable level of each sample could be 50 oocysts. There are no significant differences between different kinds of detergent. The method for the detection of Cyclospora oocysts adsorped to fruit or vegetables was developed primarily. It is quick, sensitive, and specific for the detection of the food-borne pathogen.

Cyclosporaoocysts; 18S rRNA; detectable sensitivity；nested PCR

1000-2340(2014)06-0713-08

Q958.9

：A

2014-05-10

國家科技重大專項(2012ZX10004220)；河南省高校科研創(chuàng)新團隊項目(012IRTSTHN005)

孫芳芳，1987年生，女，河南禹州人，碩士研究生，從事人獸共患寄生蟲病研究．

張龍現(xiàn)，1965年生，男，河南汝州人，教授，博士生導(dǎo)師.