陳靜琦，朱必勝，侯開連

（廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院腫瘤科，廣東廣州510260）

整合素是介導細胞與細胞外基質(zhì)相互作用的主要分子，其中整合素β1主要介導細胞與纖維粘連蛋白（FN）的黏附［1］。以前認為細胞與細胞外基質(zhì)的黏附抑制細胞的遷移，但現(xiàn)在研究認為，腫瘤細胞只有黏附于細胞外基質(zhì)，才可以抵抗失巢性凋亡，而遷移就是細胞在細胞外基質(zhì)上伸出偽足，在偽足的前緣依靠整合素形成黏附，而細胞體的后緣則去黏附，使得整個細胞體前移，整個細胞在細胞外基質(zhì)上爬行，從而實現(xiàn)腫瘤的浸潤和遷移［2］。但是，什么樣的機制調(diào)控了腫瘤細胞這個黏附與去黏附的過程，目前還不清楚。

趨化因子分為CXC、CC、C等幾種類型，大量研究已經(jīng)證明趨化因子及其受體在腫瘤的浸潤和遷移中起關(guān)鍵的作用，例如SDF－1作用于受體CXCR4促進腫瘤遷移，CCL5、CCL2在腫瘤轉(zhuǎn)移中均起關(guān)鍵的作用［3］。但在趨化因子促進腫瘤趨化的過程中，發(fā)揮黏附功能的整合素起什么樣的作用，還沒有充分證明。CCL18是一種CC型的趨化因子［4］，本研究前期已經(jīng)證明乳腺癌細胞表達CCL18的受體PITPNM3，CCL18通過作用于PITPNM3產(chǎn)生乳腺癌細胞的趨化作用，從而促進乳腺癌浸潤和遷移［5］，本文將進一步研究CCL18促進乳腺癌SK－3rd細胞浸潤和遷移的分子機制，探討整合素在CCL18促遷移過程中的作用，為靶向腫瘤微環(huán)境的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 利用從ATCC購買的乳腺癌SKBR3細胞系構(gòu)建SK－3rd細胞系；Transwell培養(yǎng)板購自Corning公司，微孔直徑為0.4μm；FN購自美國Roche公司。細胞培養(yǎng)板購自Corning公司；CCL18蛋白購自R＆D公司；整合素α5β1抗體購自美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 在完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的DMEM）中培養(yǎng)SK－3rd細胞。

1.2.2 流式細胞檢測 用CCL18（20ng／mL）處理SK－3rd乳腺癌細胞1h，然后用PBS洗滌細胞，再用鼠抗人整合素α5β1抗體4℃孵育細胞15min，用同型抗體作為對照，PBS洗滌后，再加入PE標記的熒光二抗（BD Biosciences），避光情況下室溫孵育20min，然后用流式細胞儀（BD Biosciences）檢測乳腺癌細胞整合素α5β1的聚集情況。以非相關(guān)蛋白人血清蛋白（ALB）處理組和未處理組（PBS）為對照。獨立重復實驗3次。

圖1 CCL18促進乳腺癌SK－3rd細胞表面整合素α5β1的聚集

1.2.3 Western blot檢測 收集培養(yǎng)、誘導成功的細胞，加入混有蛋白酶抑制劑（Merk）的RIPA裂解液（150nmol NaCL，1%NP－40，0.5%去氫醋酸鈉，0.1%十二烷基硫酸鈉（SDS），50mmol三羥甲基氨基甲烷，pH 8.0），提取細胞總蛋白，作蛋白定量。制備電泳SDS凝膠后，每個泳道加入10～50μg提取蛋白電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore），洗膜，孵育針對Tyr397－黏著斑激酶（FAK）和β－actin的一抗（美國CST公司），洗膜，用標記辣根過氧化酶的對應的IgG二抗（美國CST公司）孵育?？乖贵w結(jié)合用化學發(fā)光劑（Thermo）觀測。在培養(yǎng)板包被或不包被FN的條件下，用Western blot的方法檢測CCL18對乳腺癌SK－3rd細胞FAK的影響。獨立重復實驗3次。

1.2.4 靶向整合素β1的siRNA轉(zhuǎn)染 胰酶消化SK－3rd細胞，用含10%胎牛血清的DMEM（Gibco）懸浮細胞，37℃放置。使siPoRT NeoFX轉(zhuǎn)染試劑（Ambion）和OPTI－MEM Ⅰ培養(yǎng)基（Invitrogen）恢復至室溫。根據(jù)說明書溶解siPORT NeoFX在OPTI－MEMⅠ培養(yǎng)基中，常溫下孵育10min。把siRNA按所需的終濃度（30nmol）溶解在OPTI－MEM Ⅰ培養(yǎng)基中?；旌先芙獾膕iRNA和轉(zhuǎn)染試劑，常溫下孵育10min，把混合液加入培養(yǎng)板，再把細胞懸液加到轉(zhuǎn)染混合物上面，輕搖培養(yǎng)板。轉(zhuǎn)染細胞在正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48h，然后用于黏附實驗。整合素β1的siRNA－1上游引物：5′－GGA AAU GGU GUU UGC AAG U－3′，下游引物：5′－ACU UGC AAA CAC CAU UUC C－3′；整合素β1的siRNA－2上游引物：5′－AAU GUA ACC AAC CGU AGC ATT－3′，下游引物：5′－ACU UGC AAA CAC CAU UUC C－3′。

1.2.5 Transwell侵襲實驗 在Transwell上層小室（24 wells，8μm，Corning）底部膜的下表面鋪10μL FN（40μg／mL，Roche），4℃放置48h；把50μL Matrigel（用無血清培養(yǎng)基1∶3稀釋，R＆D）加入Transwell的嵌套內(nèi)，37℃孵育30 min。消化收集SK－3rd乳腺癌細胞，用無血清培養(yǎng)基（DMEMF12加入2%B27、胰島素140IU和0.4%BSA）制細胞懸液，把乳腺癌細胞加入Transwell上室（105cells／well），下層小室加20%的胎牛血清和CCL18蛋白。培養(yǎng)8h后，用棉簽去除Transwell上層小室內(nèi)的基質(zhì)膠，用多聚甲醛固定黏附在Transwell小室膜下表面的侵襲細胞，用結(jié)晶紫（0.005%，sigma）染色，在400倍的光學顯微鏡下，隨機選取10個視野計數(shù)，同時拍攝圖片，獨立重復實驗3次。在CCL18存在（un組）或CCL18不存在（con組）的條件下，在Transwell培養(yǎng)板中，檢測轉(zhuǎn)染整合素β1－siRNA（si－int－1組、si－int－2組）的乳腺癌 SK－3rd細胞浸潤遷移功能（n＝3），以單用轉(zhuǎn)染試劑（mock組）、轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白（GFP）的siRNA（si－GFP組）為對照。

2 結(jié) 果

2.1 CCL18促進SK－3rd乳腺癌細胞表面整合素α5β1的聚集乳腺癌細胞與細胞外基質(zhì)的黏附在乳腺癌的浸潤和遷移過程中起關(guān)鍵的作用，整合素是乳腺癌細胞表面的黏附分子，故在乳腺癌細胞黏附和浸潤遷移中起關(guān)鍵的作用，本結(jié)果表明CCL18作用于乳腺癌細胞，引起SK－3rd細胞表面整合素α5β1的聚集（圖1），從而啟動了乳腺癌細胞黏附于細胞外基質(zhì)的過程。

2.2 CCL18促進SK－3rd乳腺癌細胞中FAK的磷酸化激活本研究用CCL18和細胞外基質(zhì)FN處理乳腺癌SK－3rd細胞，用Wester blot檢測FAK的磷酸化激活，結(jié)果觀察到CCL18可以使SK－3rd細胞中在Tyr397位點磷酸化FAK蛋白量升高，表明CCL18可以磷酸化激活FAK，見圖2。

圖2 CCL18引起乳腺癌SK－3rd細胞中FAK的激活

圖3 各組SK－3rd乳腺癌細胞浸潤和遷移比較

2.3 CCL18通過整合素促進SK－3rd乳腺癌細胞浸潤和遷移在證明CCL18可以引起整合素在乳腺癌細胞表面聚集的基礎(chǔ)上，進一步把針對整合素β1的siRNA通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入乳腺癌細胞，經(jīng)過48h沉默整合素β1的表達，檢測CCL18對乳腺癌SK－3rd細胞浸潤和遷移的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Transwell侵襲實驗中，與沒有CCL18處理組比較，CCL18使乳腺癌SK－3rd細胞浸潤遷移數(shù)量增加10倍（P＜0.01，圖3），轉(zhuǎn)染GFP siRNA或單純加入脂質(zhì)體（mock）沒有影響CCL18促乳腺癌細胞浸潤和遷移的作用，轉(zhuǎn)染靶向整合素β1的siRNA－1和si－RNA－2可以抑制CCL18促進乳腺癌細胞浸潤和遷移的作用，浸潤和遷移細胞數(shù)恢復到?jīng)]有CCL18作用的水平（P＞0.05，圖3），證明CCL18通過促進整合素的聚集可促進乳腺癌細胞浸潤和遷移。

3 討 論

以前的研究認為細胞的黏附抑制腫瘤細胞的浸潤和遷移，但細胞黏附功能的系統(tǒng)研究認為，細胞的黏附分為細胞與細胞外基質(zhì)的黏附和細胞與細胞之間的黏附［6］，如果沒有細胞與周圍細胞或細胞外基質(zhì)的黏附，細胞就會出現(xiàn)失巢性凋亡，就不能維持增殖、遷移的生物學功能［7］。腫瘤細胞在周圍環(huán)境的支撐下，在微環(huán)境中生物活性因子的誘導下，運動能力增強，浸潤和遷移的能力增強［8］，實質(zhì)上腫瘤細胞的遷移是細胞在細胞外基質(zhì)上的一種滾動樣的爬行。整合素是腫瘤細胞表面的黏附分子，是細胞外基質(zhì)成分的受體［9］，介導腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)的黏附［10］。整合素發(fā)揮黏附功能，首先表現(xiàn)為聚集［11］，而且腫瘤細胞周圍的生物活性因子可以作用于腫瘤細胞，誘導整合素的聚集，從而促進腫瘤細胞的黏附功能。

趨化因子促進腫瘤細胞的趨化［11－12］。CCL18在乳腺癌微環(huán)境中，是一種來源于腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor associated macrophages，TAM）的CC型趨化因子［13］，在本研究前，關(guān)于CCL18的研究主要集中在CCL18對樹突狀細胞、淋巴細胞的趨化作用［14］，還少有研究CCL18對腫瘤細胞的作用，嚴重影響了這種趨化因子功能的闡明。本課題的前期研究證明CCL18與乳腺癌細胞表面受體PITPNM3結(jié)合，促進乳腺癌浸潤和遷移，CCL18可促進乳腺癌細胞黏附于細胞外基質(zhì)［5］。

在本研究證明TAM來源的CCL18作用于乳腺癌細胞，促進乳腺癌細胞表面整合素α5β1的聚集，整合素的聚集引起黏著斑形成，從而促進乳腺癌細胞黏附。整合素α5β1的配體是細胞外基質(zhì)中的FN，CCL18引起整合素α5β1聚集的同時，引起乳腺癌細胞內(nèi)FAK的磷酸化激活，從而進一步激活細胞內(nèi)的信號傳導通路，同時也證明沉默整合素β1，抑制CCL18促進乳腺癌細胞黏附的功能，可以抑制CCL18促進乳腺癌浸潤和遷移的作用。說明整合素介導的乳腺癌細胞黏附于細胞外基質(zhì)是乳腺癌浸潤和遷移的關(guān)鍵步驟，初步闡明了CCL18促進乳腺癌浸潤和遷移的機制，為抑制CCL18促乳腺癌浸潤遷移提供了實驗依據(jù)。

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