姜洪帥，竇德強(qiáng)

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

研究開(kāi)發(fā)

腸道微生物對(duì)牛蒡苷的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化酶的初步研究△

姜洪帥，竇德強(qiáng)*

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

目的：研究人腸內(nèi)細(xì)菌對(duì)牛蒡苷48 h的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化酶的性質(zhì)。方法：采用人腸內(nèi)細(xì)菌的混合菌液與牛蒡苷在37 ℃厭氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)；采用硅膠柱色譜和制備HPLC分離轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；根據(jù)核磁共振波譜鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)；采用超聲破碎方法，提取人腸內(nèi)細(xì)菌總酶。結(jié)果：牛蒡苷在48 h內(nèi)可被人腸內(nèi)細(xì)菌轉(zhuǎn)化為牛蒡苷元和牛蒡苷元脫甲基化產(chǎn)物；轉(zhuǎn)化酶可能為組成酶和誘導(dǎo)酶。結(jié)論：牛蒡苷在48 h時(shí)主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為牛蒡苷元和脫甲基化產(chǎn)物。

牛蒡苷；人腸內(nèi)細(xì)菌；生物轉(zhuǎn)化；酶

中藥主要以傳統(tǒng)水煎液口服的方式使用，因此中藥有效成分的轉(zhuǎn)化吸收和代謝主要發(fā)生在胃腸道和肝臟。人體的消化道中寄居著100多種微生物，數(shù)量一般為1012～1014個(gè)，微生物的種群和數(shù)量影響著人體的健康，有學(xué)者將腸道內(nèi)具有調(diào)控代謝和化學(xué)轉(zhuǎn)化能力的微生物群落作為人體的一個(gè)新器官[1]。微生物在體內(nèi)寄居時(shí)，產(chǎn)生和分泌多種酶類(lèi)，在維持微生物自身新陳代謝的同時(shí)，對(duì)經(jīng)過(guò)胃腸道的食物和藥物進(jìn)行酶催化性生物轉(zhuǎn)化，進(jìn)而幫助攝入食物和藥物的轉(zhuǎn)化和吸收。酶催化的化學(xué)反應(yīng)具有效率高、區(qū)域選擇性和立體選擇性強(qiáng)、副產(chǎn)物少、反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)[2]。牛蒡子作為傳統(tǒng)中藥被廣泛使用，牛蒡苷為其主要的木脂素類(lèi)成分，目前報(bào)道牛蒡苷藥理作用的文獻(xiàn)不多，而牛蒡苷元作為其水解產(chǎn)物具有多方面牛蒡苷所沒(méi)有的藥理作用，甚至在某些方面藥理作用比牛蒡苷更強(qiáng)[3]。Li等利用人和鼠的腸道微生物在體外厭氧轉(zhuǎn)化的方法，發(fā)現(xiàn)牛蒡苷通過(guò)水解、脫甲基、脫羥基的過(guò)程，經(jīng)過(guò)7 d最終轉(zhuǎn)化為動(dòng)物木脂素腸內(nèi)酯[4]。然而口服的藥物，在胃腸道中消化和吸收的時(shí)間最長(zhǎng)為72 h，一般在體內(nèi)停留時(shí)間為48 h，因此在體外研究胃腸道微生物對(duì)藥物的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，一般考察微生物對(duì)藥物的48 h轉(zhuǎn)化，延長(zhǎng)微生物對(duì)藥物在體外的轉(zhuǎn)化時(shí)間，只有微生物在體外轉(zhuǎn)化意義而沒(méi)有藥物在體內(nèi)胃腸道中的微生物轉(zhuǎn)化意義[5]。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察48 h內(nèi)牛蒡苷在體外的轉(zhuǎn)化情況，來(lái)推測(cè)牛蒡苷在體內(nèi)胃腸道的代謝情況，為尋找牛蒡苷在體內(nèi)發(fā)揮藥效的真正活性成分奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

牛蒡苷(實(shí)驗(yàn)室自制，純度≥98%)；厭氧液體培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)；甲醇(天津市登科化學(xué)試劑有限公司)；三氯甲烷(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；正丁醇(天津市進(jìn)豐化工有限公司)；甲醇(美國(guó)TE-DIA公司)。

Agilent 1260型高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)安捷倫Agilent科技公司)；HPP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京東聯(lián)哈爾儀器制造公司)；DL-CJ-1N型垂直層流單人標(biāo)準(zhǔn)操作臺(tái)；MLS-3780高壓蒸氣滅菌鍋(杭州亞旭生物科技有限公司)；KQ-250DE臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 人腸內(nèi)細(xì)菌對(duì)牛蒡苷的轉(zhuǎn)化及產(chǎn)物的分離和鑒定

2.1.1 人腸內(nèi)混合菌液的制備 收集脾胃功能正常的健康志愿者排出的新鮮糞便(3個(gè)月內(nèi)沒(méi)有服用過(guò)抗菌藥)，裝入反復(fù)多次充滿氮?dú)獾淖苑獯鼉?nèi)，加入重量與體積比為1∶1的已滅菌的厭氧肉湯培養(yǎng)基，用手?jǐn)D壓，使糞便均勻化，孔徑為1 mm紗布過(guò)濾，得到人腸內(nèi)細(xì)菌的混合液。

2.1.2 牛蒡苷在混合菌液中的轉(zhuǎn)化 吸取上述混合菌液體積的1/10，加入10倍量的培養(yǎng)基和50 mg的牛蒡苷，放入保干器內(nèi)，通過(guò)燭缸法和焦性沒(méi)食子酸化學(xué)吸氧法除去容器中的氧氣，當(dāng)厭氧指示劑試紙顯示白色后表明達(dá)到厭氧狀態(tài)。將保干器放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，在37 ℃下厭氧培養(yǎng)48 h。

2.1.3 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離和鑒定 向48 h的轉(zhuǎn)化液中加入等體積的正丁醇(水飽和，0.1%乙酸酸化)，搖勻，4 000 r·min-1離心30 min，分層，反復(fù)萃取離心3次，合并正丁醇層，旋轉(zhuǎn)蒸干，硅膠柱色譜CHCl3-CH3OH(100∶0→100∶1)梯度洗脫，制備HPLC純化，得到化合物2和3。

化合物2：無(wú)色針狀結(jié)晶，通過(guò)HPLC圖和TLC法與牛蒡苷元對(duì)照品比較，確定化合物2為牛蒡苷元。

化合物3：棕色粉末狀固體，13C-NMR(CDCl3，500 MHz)：179.5(C-1)，46.5(C-2)，41.0(C-3)，71.6(C-4)，130.6(C-1′)，116.2(C-2′)，144.0(C-3′)，142.9(C-4′)，115.3(C-5′)，121.6(C-6′)，34.2(C-7′)，130.6(C-1")，112.0(C-2")，149.1(C-3")，147.9(C-4")，111.5(C-5")，120.8(C-6")，38.2(C-7")，56.0，55.9(-CH3×2)。通過(guò)與文獻(xiàn)[4]數(shù)據(jù)比較，確定化合物3為牛蒡苷元脫甲基產(chǎn)物。

根據(jù)化合物2和3的結(jié)構(gòu)，推斷牛蒡苷的轉(zhuǎn)化路徑如圖1所示。

采用HPLC監(jiān)測(cè)牛蒡苷的轉(zhuǎn)化過(guò)程，色譜柱為Agilent ZORBAX-SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(46∶54)，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃。牛蒡苷轉(zhuǎn)化的HPLC圖見(jiàn)圖2。

圖1 人腸內(nèi)細(xì)菌對(duì)牛蒡苷的生物轉(zhuǎn)化路徑

1.牛蒡苷 2.牛蒡苷元 3.3″-去甲基牛蒡苷元A.糞便空白溶液 B.牛蒡苷起始轉(zhuǎn)化溶液 C.牛蒡苷48 h轉(zhuǎn)化溶液圖2 牛蒡苷轉(zhuǎn)化的HPLC圖

2.2 人腸內(nèi)微生物粗酶的提取及對(duì)牛蒡苷的轉(zhuǎn)化

取40 g新鮮糞便，按照質(zhì)量與體積比為1∶5加入4 ℃、pH 7.2的緩沖溶液，孔徑為1 mm的紗布過(guò)濾，制備糞便混懸液。取50 mL濾液在冰浴條件下，200 W超聲破碎細(xì)胞，超聲3 s，停3 s，在4 ℃、10 000 r·min-1條件下離心10 min，收集上清液，作為總酶。向總酶溶液中加入50 mg的牛蒡苷，置于37 ℃下轉(zhuǎn)化48 h。另取50 mL糞便混合液，加入50 mg的牛蒡苷，在37 ℃厭氧條件下轉(zhuǎn)化48 h，作為與總酶轉(zhuǎn)化的對(duì)照。分別取48 h的總酶轉(zhuǎn)化液和糞便混合液的轉(zhuǎn)化液萃取離心、點(diǎn)板，三氯化鐵試劑顯色。結(jié)果表明總酶轉(zhuǎn)化液只有1種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，為牛蒡苷元；糞便混合液存在兩種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，分別為牛蒡苷元和牛蒡苷元脫甲基化產(chǎn)物。

3 討論

通過(guò)牛蒡苷在體外的48 h轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)牛蒡苷可以全部轉(zhuǎn)化成牛蒡苷元，而牛蒡苷元有部分轉(zhuǎn)化為化合物3，這與存在的轉(zhuǎn)化酶的性質(zhì)有一定的聯(lián)系。在總酶提取液中，可以使牛蒡苷水解為牛蒡苷元，說(shuō)明水解酶可能是一種人體胃腸道分泌的消化酶，也可能是微生物體內(nèi)的一種組成酶，而在微生物超聲破碎以后，微生物死亡，總酶釋放到溶液中，而總酶并不能對(duì)牛蒡苷元進(jìn)行轉(zhuǎn)化，由此可以說(shuō)明脫甲基酶是微生物的一種誘導(dǎo)酶，需要底物牛蒡苷元誘導(dǎo)一段時(shí)間后活體微生物才會(huì)產(chǎn)生，進(jìn)而催化轉(zhuǎn)化的進(jìn)行。從48 h的結(jié)果分析，牛蒡苷轉(zhuǎn)化成牛蒡苷元非常完全，牛蒡苷元脫甲基轉(zhuǎn)化不完全，說(shuō)明脫甲基過(guò)程是控制轉(zhuǎn)化的限速步驟。牛蒡苷在體內(nèi)發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)可能是牛蒡苷元和牛蒡苷元脫甲基化轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

[1] 劉開(kāi)朗，王佳啟，卜登攀，等.人體腸道微生物多樣性和功能研究進(jìn)展[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，30(5)：2589-2594.

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[5] 楊秀偉，徐嵬.中藥化學(xué)成分的人腸內(nèi)細(xì)菌生物轉(zhuǎn)化模型和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的建立[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36(1)：19-26.

The Biotransformation of Arctiin by Human Intestinal Bacteria and Enzymes

JIANG Hongshuai，DOU Deqiang*

(CollegeofPharmacy，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China)

Objective：To study the biotransformation of arctiin by human intestinal flora(HIF)within 48 h and the characteristics of transformation enzymes.Methods：The arctiin was anaerobically incubated with HIF at 37 ℃ for 48 h.The biotransformation products were isolated and purified by silica gel column chromatography and prepared HPLC.Chemical structures of the transformed products were determined by nuclear magnetic resonance(NMR)method.The enzymes of HIF were extracted by ultrasonication.Results：Arctiin was converted to arctigenin and 3″-demethylarctigenin.Its transform enzymes were probably constitutive enzymes and induced enzymes.Conclusion：The main biotransformation products of arctiin were arctigenin and 3″-demethylarctigenin within 48 h.

Arctiin；Human intestinal bacteria；Biotransformation；Enzyme

沈陽(yáng)市科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目(F11-264-1-20)；遼寧省高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(LT2013020)

*[通信作者] 竇德強(qiáng)，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥效(性)物質(zhì)基礎(chǔ)及新藥開(kāi)發(fā)研究；Tel：(0411)87406497，E-mail：deqiangdou@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.01.003

2013-09-13)