何婷玉+++杜玉文+++陳肖楠+等

[摘要] 目的 探討siRNA沉默DNA聚合酶β（polβ）基因表達(dá)對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞放療敏感性的影響。 方法 利用脂質(zhì)體將siRNA轉(zhuǎn)染至EC9706細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)3組不同轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中polβ mRNA的表達(dá)變化；不同劑量（0、2、4、6、8 Gy）照射3組細(xì)胞，CCK8方法檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率；用3 Gy照射，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)每組細(xì)胞的凋亡率。 結(jié)果 轉(zhuǎn)染沉默polβ組polβ基因表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）；CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著照射劑量的增加，細(xì)胞存活率呈下降趨勢(shì)，其中沉默polβ組細(xì)胞存活率顯著低于兩個(gè)對(duì)照（P<0.05）；沉默polβ組細(xì)胞凋亡率顯著高于無(wú)關(guān)siRNA組或空白對(duì)照組（P<0.01），照射后沉默polβ組細(xì)胞的凋亡率增加量顯著高于無(wú)關(guān)siRNA組和空白對(duì)照組（P<0.01）。 結(jié)論 沉默食管癌細(xì)胞polβ基因表達(dá)可增加其對(duì)放療的敏感性。

[關(guān)鍵詞] 聚合酶β；siRNA；食管癌；放療敏感性

[中圖分類號(hào)] R735.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）08（c）-0004-04

DNA聚合酶β（DNA polymerase β，polβ）是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物核內(nèi)的單鏈小分子蛋白質(zhì)，屬于DNA聚合酶家族中的一員[1]，在DNA合成、損傷及修復(fù)中起關(guān)鍵作用[2]，該酶的穩(wěn)定性較差，催化活性較低，催化反應(yīng)過(guò)程易受多種因素影響，是復(fù)制保真度較低的DNA聚合酶[3]，一系列的DNA體外復(fù)制實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了polβ基本不參與DNA復(fù)制，而可能在DNA損傷修復(fù)過(guò)程中起一定的作用，如參與堿基切除修復(fù)過(guò)程（base excision repair，BER）[4]。針對(duì)polβ基因的不同特性，國(guó)內(nèi)外不同學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了不同的研究，其中有結(jié)果顯示，polβ在射線、烷化劑等誘導(dǎo)的DNA單鏈斷裂（single strand break，SSB）修復(fù)中起重要作用[5]，也有研究顯示，在腫瘤放射治療過(guò)程中，polβ作為重要修復(fù)因子調(diào)控著腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，polβ在食管癌組織中高表達(dá)，本研究進(jìn)一步探討了沉默polβ基因的表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞株放療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人食管癌細(xì)胞EC9706（鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院保存），胎牛血清、1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶（均購(gòu)置于美國(guó)Gibco公司），RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑和Taq DNA聚合酶（加拿大Fermentas 公司）。polβ引物、GAPDH引物（上海生工技術(shù)有限公司）。

1.2 siRNA的設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank中polβ基因的編碼序列（NM_002 690），使用網(wǎng)上設(shè)計(jì)軟件（www.dharmacon.com）設(shè)計(jì)出siRNA、siRNA-polβ和siRNA-scramble，具體序列分別為：5′-GAACGTGAGCCAAGCTATC-3′和5′-GAGTAACCGATAGCGCATC-3′，由Ambion公司合成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清、雙抗（1×105 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素）的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)EC9706細(xì)胞，細(xì)胞貼滿培養(yǎng)瓶瓶底約75%時(shí)可傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。將收集的細(xì)胞懸液接種于六孔板，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，給予新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞融合度接近50%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染依據(jù)Lipofectamine 2000使用說(shuō)明進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)分為3組：沉默polβ組、無(wú)關(guān)siRNA對(duì)照組、空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞饑餓24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 X線照射

VARIAN直線加速器6 MV-X射線照射，劑量率為2 Gy/min，源皮距100 cm，照射野10 cm×10 cm，培養(yǎng)板下置1 cm等效組織填充物。

1.5 RT-PCR檢測(cè) polβ mRNA的表達(dá)

收集3組細(xì)胞，分別提取總RNA（Invitrogen），Nanadrop 2000熒光分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品的濃度和純度。應(yīng)用First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒以O(shè)ligo dT為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR采用TaqMan方法檢測(cè)polβ mRNA表達(dá)，Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，polβ上游5′-GTGCAGAGTCCAG-TGGTGACA-3′；polβ下游5′-CAGTTTTGGCTGTTTGGTTGATT-3′；探針序列：5′-FAM-ATGTTCTCCTGACCCATCCCAGCTTCAC-TAMMR-3′。內(nèi)參β-actin引物：上游5′-TTCACTTCTTCAGTTCTGCCATCT-3′；下游5′-CCAAGCTTTTCTCAGTCCCATAA-3′；探針序列：5′-FAM-TCAAAGGGCTCCAGCCTCACTCAGTC-TAMMR-3′。PCR反應(yīng)條件：50℃ 2 min、95℃ 2 min、95℃ 15 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法分析樣品中目的基因的相對(duì)表達(dá)率。

1.6 CCK8檢測(cè)EC9706細(xì)胞的放射敏感性

細(xì)胞增殖測(cè)定采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（Dojindo，Gaithersburg，MD）根據(jù)其說(shuō)明書進(jìn)行操作。分別取轉(zhuǎn)染后呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的3組細(xì)胞，采用不同劑量（0、2、4、6、8 Gy）X線照射，PBS清洗，胰酶消化，PBS洗滌后混懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×103個(gè)/μl轉(zhuǎn)入96孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，連續(xù)培養(yǎng)2 d，在最后4 h加每孔10 μl CCK8溶液。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，于分光光度計(jì)450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光值，根據(jù)吸光值推測(cè)出不同處理組的活細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)EC9706細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡檢測(cè)使用Annexin V-FICT/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Abcam），根據(jù)其說(shuō)明書進(jìn)行操作。取轉(zhuǎn)染后呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的3組細(xì)胞，每組細(xì)胞分2個(gè)小組，一小組采用3 Gy X線照射，另一個(gè)小組作為對(duì)照，胰酶消化，PBS洗滌后混懸細(xì)胞，調(diào)整每管細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，依次加入Annexin V-FICT和碘化丙啶（PI）試劑，室溫，避光15 min后，即采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)（Becton Dickinson）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各組參數(shù)的比較用One-way ANOVA進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后polβ mRNA的相對(duì)表達(dá)量

收集轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，提取總RNA，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法，對(duì)各處理組polβ mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)沉默polβ組polβ mRNA相對(duì)表達(dá)量與無(wú)關(guān)siRNA對(duì)照組、空白對(duì)照組比較均顯著降低（P<0.01），無(wú)關(guān)siRNA對(duì)照組、空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.913）2.2 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞放射敏感性的結(jié)果

采用CCK8法檢測(cè)各處理組細(xì)胞的存活率發(fā)現(xiàn)，隨著照射劑量的增加，細(xì)胞存活率呈下降趨勢(shì)，其中沉默polβ組下降趨勢(shì)較顯著，且在不同劑量照射時(shí)均與無(wú)關(guān)siRNA對(duì)照組、空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），無(wú)關(guān)siRNA組與空白對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果

沉默polβ組（凋亡率為7.3%）較無(wú)關(guān)siRNA組（3.8%）或空白對(duì)照組（3.2%）細(xì)胞凋亡增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而沉默polβ轉(zhuǎn)染聯(lián)合照射組（17.8%）與沉默polβ組、無(wú)關(guān)siRNA組、空白對(duì)照組或無(wú)關(guān)siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合照射組（11.2%）、空白組聯(lián)合照射組（10.6%）比較，細(xì)胞凋亡增加更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示沉默polβ可以誘導(dǎo)EC9706細(xì)胞的凋亡，且可增加細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。

3 討論

食管癌是全球最常見(jiàn)的六大惡性腫瘤之一，全世界每年約有30萬(wàn)人死于食管癌。我國(guó)是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一，每年平均病死約15萬(wàn)人，居惡性腫瘤的第4位。食管癌患者的預(yù)后較差，多數(shù)食管癌患者在確診時(shí)已發(fā)生局部侵襲或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，手術(shù)往往難以進(jìn)行，而只能選擇姑息性治療，放射治療是食管癌主要的姑息性治療方法之一，但放療后的臨床療效卻不盡人意，5年生存率僅為10%～30%，腫瘤局部未控率和復(fù)發(fā)率高達(dá)60%～80%[6]。提高食管癌放療的療效是目前研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，多種基因及其表達(dá)產(chǎn)物，如細(xì)胞周期調(diào)控基因[7]、凋亡基因[8-9]、DNA損傷修復(fù)蛋白[10-11]等，影響腫瘤放射敏感性。DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)存在于所有細(xì)胞中，且在腫瘤細(xì)胞中已被證實(shí)是抵抗放療或?qū)е履[瘤細(xì)胞對(duì)放療不敏感的重要機(jī)制之一，作為DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)中重要的一員，polβ調(diào)控腫瘤細(xì)胞的放射治療敏感性是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

RNA干擾是內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA誘發(fā)的mRNA水平上的基因沉默機(jī)制，小片段干擾性RNA通過(guò)序列特異性的降解作用，能有效封閉靶mRNA和降低蛋白水平[12]。RNAi技術(shù)的發(fā)展日趨成熟，憑借其高穩(wěn)定性、高效性、高特異性、可遺傳性、可擴(kuò)散性等特點(diǎn)，該技術(shù)已經(jīng)成為一種基因功能研究的重要工具[13]。Bentley等[14]發(fā)現(xiàn)，采用RNAi技術(shù)可以顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲能力；另有研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用RNAi技術(shù)下調(diào)相應(yīng)靶蛋白表達(dá)后，細(xì)胞的放療敏感性顯著增強(qiáng)[15-16]。

基于以上研究背景，本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，polβ在食管癌組織中高表達(dá)的基礎(chǔ)上，選擇沉默polβ基因轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞，探討其對(duì)食管癌細(xì)胞株放射治療敏感性的影響。通過(guò)RT-PCR技術(shù)證實(shí)了siRNA-polβ明顯抑制了polβ基因的表達(dá)，采用CCK8方法檢測(cè)到沉默polβ組的食管癌細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性較無(wú)關(guān)siRNA組、空白對(duì)照組有明顯增高的趨勢(shì)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各處理組細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)一步顯示，polβ基因沉默增加了食管癌細(xì)胞株的放射治療敏感性，這在一定程度上增加了對(duì)polβ基因在DNA修復(fù)中作用的規(guī)律和機(jī)制的認(rèn)識(shí)，也預(yù)示了RNA干擾技術(shù)在未來(lái)食管癌及其他腫瘤的基因治療方面將具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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（收稿日期：2014-06-18 本文編輯：林利利）

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（收稿日期：2014-06-18 本文編輯：林利利）