劉春花，楊 政，李 娜，鞏 平△

（1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子832000；2.石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，新疆石河子832000）

肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，病死率居所有惡性腫瘤之首。其遠處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTC）的出現(xiàn)是發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的前提，是形成轉(zhuǎn)移灶的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1－2］。有研究顯示，CTC不僅可有效判斷肺癌患者預(yù)后，還能預(yù)測和監(jiān)測輔助治療效果［1，3］。本研究旨在應(yīng)用免疫磁珠陰性富集聯(lián)合免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測肺癌患者的CTC，分析其與患者臨床病理因素的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2012年9月至2013年6月肺癌患者65例（肺癌組），男49例，女16例，年齡40～76歲，平均60.8歲；鱗癌24例，腺癌19例，小細(xì)胞肺癌13例，其他（腺鱗癌、大細(xì)胞癌、肺泡細(xì)胞癌、癌肉瘤）9例。肺良性疾病患者10例（肺良性疾病組），男7例，女3例，年齡38～73歲，平均58.3歲；肺炎4例，支氣管哮喘急性發(fā)作3例，慢性阻塞性肺疾?。–OPD）急性發(fā)作2例，慢性支氣管炎急性發(fā)作1例。健康志愿者10例（健康組），男6人，女4人，年齡35～70歲，平均56.1歲。納入研究對象按各自設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)。肺癌組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡18～80歲；（2）經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為肺癌；（3）入組前未接受任何抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）缺乏肺癌病理學(xué)診斷；（2）已接受手術(shù)化療及放療；（3）有其他惡性腫瘤病史；（4）依從性差。肺良性疾病組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合非腫瘤相關(guān)疾病臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）有微生物學(xué)或組織學(xué)證據(jù)；（3）病理學(xué)檢查除外肺惡性腫瘤。健康組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡18～80歲；（2）無肺癌相關(guān)高危因素；（3）常規(guī)體檢及肝腎功能無異。肺良性疾病組及健康組統(tǒng)稱對照組，所有研究對象均簽署知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 抗CD45磁珠抗體購自德國Miltenyi Biotec公司；鼠抗Pan－CK購自美國Cell Signaling公司；Envision試劑盒購自中杉金橋公司（批號：Cat NO.D11－110）。

1.2.2 樣本采集 嚴(yán)格消毒后，應(yīng)用真空采血針采集肘正中靜脈血，棄去穿刺后的前2mL，采集此后的7.5mL靜脈血加入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管，并在采集后的24h內(nèi)富集腫瘤細(xì)胞。

1.2.3 免疫磁珠富集 將血液和淋巴細(xì)胞分離液復(fù)溫至18～25℃，取7.5mL抗凝血與等量PBS液充分混勻后，緩慢貼壁加入淋巴細(xì)胞分離液層面上（2∶1）；室溫下2 000r／min（離心半徑16cm）離心20min；吸取環(huán)狀乳白色單核細(xì)胞層，加入5 mL PBS液重復(fù)洗2次，室溫下2 000r／min（離心半徑16cm）離心15min。將細(xì)胞沉淀重懸于80μL磁珠緩沖液中，加入20μL抗CD45抗體，用手輕輕敲打混勻后置于4℃冰箱孵育15min；再加入2mL磁珠緩沖液，室溫下2 000r／min（離心半徑16cm）離心10min；棄上清液（用槍尖吸取上清液，留1mm水膜），加入500μL緩沖液重懸細(xì)胞。將細(xì)胞重懸液過磁珠MS分流柱，加入500μL磁珠緩沖液洗滌MS分流柱2次，收集從分流柱下流出的液體，室溫下2 000r／min（離心半徑16 cm）離心10min；棄上清液，沉淀均勻涂于防脫載玻片上，室溫風(fēng)干后4%多聚甲醛固定10min，PBS洗3次，每次5min，室溫風(fēng)干。如不立即進行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，待玻片干燥后置于－80℃冰箱備測。

｀1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色（Envision法） 取出切片，PBS洗3次，每次5min，加入細(xì)胞角蛋白（Pan－CK）抗體，4℃冰箱過夜。PBS洗3次，每次5min，加二抗（Envision工作液），37℃溫箱孵育20min。PBS浸洗3次，每次5min，DAB溶液顯色。蘇木素復(fù)染3～5min，酸酒精分化、脫水、透明、中性樹膠封片。

1.2.5 CTC的判定標(biāo)準(zhǔn)及陽性定義 形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)：（1）細(xì)胞呈圓形、橢圓形或長形，長徑大于10μm；（2）光鏡下可見完整細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞核。光鏡陽性標(biāo)準(zhǔn)：（1）有完整細(xì)胞膜，Pan－CK染色陽性，細(xì)胞質(zhì)呈藍黑色或褐色；（2）細(xì)胞長徑大于10 μm；（3）核漿比失常。結(jié)果判定：由兩位經(jīng)培訓(xùn)實驗員在光鏡下分別觀察細(xì)胞顯色情況，有分歧時由第3人協(xié)助判定。陽性界定值：目前尚無國際標(biāo)準(zhǔn)化CTC的陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，本文以見到CTC即為陽性結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用列聯(lián)表分析，確切概率法檢驗，計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CTC檢測結(jié)果 對照組（20例）中均未檢出CTC，肺癌組中45例檢出CTC，陽性率為69.23%（45／65），CTC數(shù)值為1～58個，中位數(shù)4個。兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝8.047，P＝0.018），見圖1。

圖1 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果（Envision×400）

2.2 CTC與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 對65例肺癌患者CTC與臨床特征間的關(guān)系進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明，TNM分期Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者CTC陽性率分別為23.08%（3／13）、50.00%（6／12）、90.00%（36／40），各亞組 CTC陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.000）；轉(zhuǎn)移性（M1期）肺癌患者CTC陽性率為83.33%（35／42），較非轉(zhuǎn)移性（M0期）肺癌患者CTC陽性率43.48%（10／23）顯著升高（P＝0.002）；隨著轉(zhuǎn)移部位個數(shù)（0、1、2、3）的增多，CTC陽性率呈升高趨勢（43.48%、83.33%、87.50%、75.00%），各亞組CTC陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.024）；CTC陽性率在Pan－CK19片段（Cyfra21－1）＜5.6μmol／L組（53.33%，16／30）與Cyfra21－1≥5.6μmol／L組（82.86%，29／35）間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.021）；在乳酸脫氫酶（LDH）＜270U／L組（55.0%，22／40）與LDH≥270 U／L組（92.0%，23／25）間差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.004）。而CTC陽性率與肺癌患者病理類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移的部位及癌胚抗原（CEA）值均無關(guān)（P＞0.05），見表1。

表1 65例肺癌患者CTC與臨床病理特征的關(guān)系

續(xù)表1 65例肺癌患者CTC與臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

遠處轉(zhuǎn)移是肺癌的惡性標(biāo)志和重要特征，也是導(dǎo)致肺癌患者治療失敗和死亡的主要原因。而研究顯示，CTC與肺癌患者的隱性微轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的前提，形成轉(zhuǎn)移灶的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1－2］。本研究發(fā)現(xiàn)，在13例早期肺癌患者中有3例（23.08%，3／13）檢出CTC，同樣證明CTC的全身擴散是肺癌發(fā)生、發(fā)展的早期事件，雖然血液中檢測到CTC并不意味著必定形成轉(zhuǎn)移灶，但有助于及早確定轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)高危人群，加強這部分患者的隨訪并采取相應(yīng)的治療措施，對減少腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、提高生存率具有重要意義。

隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，在CTC檢測中，細(xì)胞富集技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用，使得檢測的敏感性和特異性亦大大提高［4］。目前，免疫細(xì)胞化學(xué)染色仍是評價CTC檢測方法的金標(biāo)準(zhǔn)［5］。由于該技術(shù)檢測的細(xì)胞數(shù)量少，檢出率低，本研究加用了免疫磁珠陰性富集法富集CTC，以更好地獲取腫瘤靶細(xì)胞。免疫磁珠系統(tǒng)對外周血CTC具有高效的回收率（＞85%）［6］。本實驗中，采用免疫磁珠陰性富集聯(lián)合免疫細(xì)胞化學(xué)染色分離鑒定CTC，65例肺癌患者中45例檢出CTC，總陽性率為69.23%，與周小昀等［7］報道基本一致；10例肺良性疾病患者及10例健康志愿者中均未檢出CTC，證實檢測具有極高的特異性（100%）。

近幾年，大量的研究證明CTC在肺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中起重要作用，是可能更有效評估患者預(yù)后，及時監(jiān)測病情進展的指標(biāo)。De Giorgi等［8］研究發(fā)現(xiàn)，CTC對腫瘤患者的預(yù)后預(yù)測較其他的方法更準(zhǔn)確，比PET－CT的方法更加敏感和經(jīng)濟。Hou等［9］檢測了97例小細(xì)胞肺癌患者的CTC，發(fā)現(xiàn)CTC計數(shù)與無進展生存期（PFS）、總生存期（OS）均呈負(fù)相關(guān)，多因素分析顯示，CTC可作為患者PFS和OS的獨立預(yù)測指標(biāo)。Krebs等［10］檢測了101例晚期非小細(xì)胞肺癌患者CTC，亦得出CTC計數(shù)是預(yù)測患者OS的最有價值的獨立指標(biāo)。因此，檢測肺癌CTC狀態(tài)對準(zhǔn)確判斷患者預(yù)后，及早發(fā)現(xiàn)疾病進展及制訂個體化治療方案具有重要意義。本研究分析65例肺癌患者CTC與臨床特征的關(guān)系，結(jié)果顯示CTC陽性率與患者病理類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移的部位（肝、腦、骨、腎上腺、胸膜）無關(guān)，與肺癌患者的臨床分期、M分期、發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移部位的個數(shù)密切相關(guān)，與國外研究結(jié)果相一致［11］。臨床分期越晚，CTC檢出率更高，且M1期患者CTC陽性率較M0期患者明顯升高（83.33%vs.43.48%），提示CTC陽性與遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，進一步證實了CTC在遠處轉(zhuǎn)移病灶形成中的重要作用；而在M0期即影像學(xué)未發(fā)現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移的患者中仍有如此高的CTC檢出率，提示在監(jiān)測肺癌遠端轉(zhuǎn)移方面，CTC較傳統(tǒng)的影像學(xué)等檢查更加及時、敏感，有利于肺癌患者的個體化治療。

腫瘤標(biāo)志物反應(yīng)腫瘤的發(fā)生、存在與生長。國外有研究報道［12］：腫瘤標(biāo)志物升高程度與癌細(xì)胞數(shù)量及轉(zhuǎn)移有關(guān)。血清中Cyfra21－1的水平可作為肺癌手術(shù)和放化療后追蹤早期復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的有效指標(biāo)，其高值提示疾病處于進展期且預(yù)后不佳［13－14］。LDH是一種糖酵解酶，在惡性腫瘤患者中LDH 明顯增高［15］，且有報道血清LDH隨著肺癌患者病情的進展呈逐漸升高的趨勢［16］。本文觀察了Cyfra21－1及LDH與CTC的關(guān)系：Cyfra21－1、LDH二者高值組CTC陽性率較低值組明顯升高 （Cyfra21－1：53.33%vs.82.86%；LDH：55.00%vs.92.00%），初步研究表明CTC與Cyfra21－1及LDH具有一定相關(guān)性，下一步應(yīng)擴大樣本量，并對患者進行隨訪跟蹤，動態(tài)監(jiān)測患者CTC、Cyfra21－1及LDH，觀察其治療后是否仍具有相關(guān)性，進一步研究CTC在判斷肺癌患者預(yù)后的臨床價值。

CTC是形成遠處轉(zhuǎn)移灶的重要前提和基礎(chǔ)，及早檢測CTC對臨床醫(yī)師準(zhǔn)確判斷預(yù)后和病情具有重要指導(dǎo)作用；動態(tài)監(jiān)測患者CTC變化，有利于及時了解患者病情，為制訂個體化的治療方案提供依據(jù)。本研究僅初步探討了肺癌患者CTC與臨床病理特征之間的關(guān)系，未來的研究應(yīng)通過隨訪觀察，進一步闡述CTC與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系，并對CTC在肺癌綜合治療中的應(yīng)用價值進行深入探討。

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