,,*, ,

(1.西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,重慶 400715； 2.西南大學(xué)三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室,重慶 400715； 3.西南大學(xué)藥學(xué)院,重慶 400715)

超聲波輔助提取山銀花綠原酸工藝及其抗氧化性研究

劉亞敏1,2,劉玉民1,2,*,李瓊3,尚艷雙1,2

(1.西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,重慶 400715； 2.西南大學(xué)三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室,重慶 400715； 3.西南大學(xué)藥學(xué)院,重慶 400715)

以山銀花為材料,采用高效液相法檢測綠原酸,建立了超聲波輔助提取綠原酸的工藝組合。通過單因素實驗研究了提取時間、固液比、超聲波功率、超聲波頻率四個主要因素對綠原酸提取的影響。在單因素實驗的基礎(chǔ)上采用L9(34)正交實驗優(yōu)選山銀花綠原酸提取工藝條件。結(jié)果表明：室溫下,溶劑為體積分數(shù)為50%的乙醇,超聲波輔助山銀花綠原酸的最佳提取工藝組合為超聲波提取50min、固液比1∶50、超聲波功率300W、超聲波頻率59kHz,在此條件下綠原酸提取率達到88.7624mg/g。驗證實驗表明該工藝組合提取率高,穩(wěn)定性良好。山銀花綠原酸提取物有一定的還原能力和較好的清除DPPH自由基的能力,是很好的功能性食品資源。

山銀花,綠原酸,超聲波輔助提取,工藝優(yōu)化

山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬(LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.)、紅腺忍冬(LonicerahypoglaucaMiq.)、華南忍冬(LoniceraconfuseDC.)或黃褐毛忍冬(LonicerafulvotomentosaHsu et S.C.Cheng)的干燥花蕾或初開的花。味甘、寒,歸肺、心、胃經(jīng),具有清熱解毒,疏散風(fēng)熱的功效。用于治療癰腫疔瘡,喉痹,丹毒,熱毒血痢,風(fēng)熱感冒及溫?zé)岚l(fā)病等[1]。現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)山銀花具有較強的抗動脈粥樣硬化作用[2]。山銀花提取物具有顯著的抗病毒作用,體外對PRV和NDV具有明顯的阻斷、抑制和中和作用,其中山銀花對PRV體外的抑制作用強于金銀花[3-4]。山銀花還被廣泛應(yīng)用于食品、飲料、保健品、化妝品和獸藥等方面[5],市場需求量在逐年增加。綠原酸為山銀花的主要活性成分之一,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,綠原酸具有廣泛的抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、提高白細胞數(shù)量、降血脂、增強免疫調(diào)節(jié)、保肝利膽作用[6-12]。山銀花中灰氈毛忍冬綠原酸含量較高,很適宜作為綠原酸的提取原料[13]。超聲波提取技術(shù)是利用超聲波輻射壓強產(chǎn)生的機械振動、空化效應(yīng)及擾動效應(yīng)等,增加溶劑穿透力,從而加速目標成分進入溶劑,促進提取的進行。近年來被廣泛的應(yīng)用于藥用植物活性成分的提取,具有節(jié)約能源、提高效率并且避免高溫對有效成分的影響等優(yōu)點[14]。目前綠原酸的提取多采用水提醇沉法、醇提鉛沉法、石灰乳沉淀法等,這些傳統(tǒng)方法提取效率較低且提取物中雜質(zhì)較多,醇提鉛沉還帶來重金屬鉛污染[14]。本實驗利用超聲波可有效提高提取效率的特點,對超聲波輔助提取山銀花綠原酸工藝組合進行了研究,采用高效液相檢測綠原酸[15],以綠原酸為考察指標,運用正交設(shè)計優(yōu)選山銀花綠原酸的最佳提取工藝組合,對目前幾個主產(chǎn)地的山銀花品種的綠原酸含量進行了檢測,并對山銀花的抗氧化能力進行了研究,以期對山銀花的深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

山銀花 采自重慶秀山山銀花生產(chǎn)基地,經(jīng)西南大學(xué)林學(xué)教研室鑒定為忍冬科灰氈毛屬植物品種為渝蕾一號,新鮮花蕾經(jīng)殺青烘干后粉碎過20目篩備用；甲醇、無水乙醇 為分析純；乙腈、磷酸 為色譜純；綠原酸標準品 色譜純≥98%中國藥品生物制品檢定所；蒸餾水 實驗室自制。

D-7000高效液相色譜儀 日本日立公司；數(shù)控超聲波清洗機SG8200HBT 上海冠特超聲儀器有限公司；電子天平FA2004B 上海越平科學(xué)儀器有限公司；SHB-3循環(huán)水多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1 綠原酸的測定方法 色譜條件：以十八烷基鍵合硅膠為填充劑,色譜柱型號為Allsphere ODS(250mm×4.6mm,2.5μm)；流動相為乙腈(A)和0.5%磷酸溶液(B)梯度洗脫,A：0～11min,10%～20%,11～21min,20%～25%,21～30min,25%～30%。流速1.0mL/min,進樣量10μL,檢測波長355nm,柱溫30℃。

1.2.2 線性關(guān)系的考察 精確稱取綠原酸對照品5g,70%甲醇溶解并定容于100mL容量瓶,搖勻,配制成濃度為50mg/mL綠原酸標準溶液。分別精確吸取綠原酸對照品溶液0、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0mL,分別置于50mL容量瓶中,以70%甲醇定容,按1.2.1色譜條件進行測定。

1.2.3 樣品的制備 精確稱取樣品粉末于設(shè)定條件下進行提取(5個重復(fù)),超聲波提取三次,濾液合并,揮干溶劑后用70%的甲醇定容于100mL容量瓶中,搖勻,從提取溶液中取1mL用70%的甲醇定容于50mL容量,于1.2.1色譜條件下進行測定,采用2.1回歸方程進行計算。

式中：Y為山銀花綠原酸提取率(mg/g)；C為依據(jù)回歸方程計算的提取液中綠原酸的質(zhì)量濃度(mg/mL)；V1為樣品提取液的總體積(100mL)；V2為測定樣品時定容體積(50mL)；V3為測定樣品時取樣體積(1mL)。

1.2.4 實驗條件 提取時間篩選：于固液比1∶30,超聲波功率200W,超聲波頻率40kHz條件下,設(shè)置提取時間為5、10、20、30、40、50、60min,研究提取時間對綠原酸提取率的影響。

固液比篩選：于超聲波功率200W,超聲波頻率40kHz,超聲波提取30min條件下,設(shè)置固液比為1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60,研究固液比對綠原酸提取率的影響。

超聲波功率篩選：于固液比1∶30,超聲波頻率40kHz,超聲波提取30min條件下,設(shè)置超聲波功率為150、200、250、300、350、400W,研究超聲波功率對綠原酸提取率的影響。

超聲波頻率篩選：于固液比1∶30,超聲波功率200W,超聲波提取30min條件下,設(shè)置超聲波頻率0、40、50、59kHz,研究超聲波頻率對山銀花綠原酸提率的影響。

取來自不同產(chǎn)地的樣品2g(5個重復(fù)),室溫下,于正交優(yōu)選條件下進行提取,采用高效液相色譜法檢測綠原酸含量。

1.2.5 正交實驗設(shè)計 根據(jù)單因素實驗的結(jié)果,確定提取時間(A)、固液比(B)、超聲波功率(C)、超聲波頻率(D)為實驗因素,進行正交實驗設(shè)計(提取溶劑為50%乙醇,于室溫條件下),選用L9(34)正交設(shè)計表進行實驗(表1),優(yōu)化山銀花綠原酸提取工藝。

表1 綠原酸正交實驗水平表Table 1 Orthogonal experiment level tableof the chlorogenic acid

1.2.6 DPPH自由基清除率測定[16]精確取DPPH粉末0.001g,用無水乙醇溶解定容于100mL容量瓶中,配制成濃度0.01mg/mL溶液備用。將山銀花綠原酸提取液配稀釋成不同濃度梯度備用。各取不同濃度的稀釋液2mL于試管中,加入2mL配制好的DPPH溶液搖勻,30min后,于517nm處測定其吸光度(A1)；以2mL無水乙醇替代2mL DPPH的測吸光度(A2)；以2mL無水乙醇替代2mL待測溶液吸光度(A0)。按照以下公式計算DPPH自由基清除率。

1.2.7 Fe3+還原力測定[16-17]取2.5mL不同濃度梯度的金銀花綠原酸提取液,加入2.5mL 0.2mol/L磷酸緩沖液(pH=6.6)和2.5mL 1%的鐵氯化鉀溶液,50℃水浴20min后快速冷卻,加入10%三氯乙酸2.5mL,取以上混合液5mL,加蒸餾水4mL及0.1%三氯化鐵溶液1mL,混合10min后于700nm處測定其吸光度。

1.3數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel和DPS軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1綠原酸檢測結(jié)果

采用1.2.1檢測方法對山銀花提取液進行檢測。根據(jù)1.2.2方法,以峰面積積分值(y)為縱坐標,對照品濃度(x)為橫坐標繪制標準曲線,得回歸方程：y=0.199x+0.0014,r=0.9997。本結(jié)果為計算綠原酸提取率的依據(jù)。

山銀花提取液中含有大量綠原酸如圖1所示,于保留時間20min處還有一主要成分峰。提取液中除2種主要成分外還含有10余種化合物。

圖1 高效液相色譜

2.2山銀花綠原酸提取的單因素實驗

2.2.1 提取時間對綠原酸提取的影響 其它條件一定時,考察提取時間對提取效果的影響,結(jié)果見圖2：隨提取時間的延長,綠原酸提取率迅速增大,當(dāng)超聲波提取超過30min時,綠原酸的提取率增加速度變緩?？紤]到綠原酸的有效溶出同時避免長時間局部高溫對提取物化學(xué)結(jié)構(gòu)的破壞并盡可能節(jié)約能源,正交實驗設(shè)計中提取時間設(shè)置為30～50min。

圖2 超聲波提取時間對綠原酸提取率的影響

2.2.2 固液比對綠原酸提取的影響 其它條件一定時,考察固液比對提取效果的影響,結(jié)果見圖3：隨溶劑量的增加,綠原酸提取率逐漸增大,固液比1∶30后綠原酸提取率趨于穩(wěn)定。原因可能是溶劑量增加后,濃度梯度變大,有利于綠原酸的溶出,從而使其溶出速度和提取率變大。當(dāng)原料里的綠原酸充分溶出后,再增大溶劑量,綠原酸的提取率也不再增加?？紤]到綠原酸有效的溶出,且不浪費溶劑,故正交實驗設(shè)計中固液比的設(shè)置為1∶30～1∶50。

圖3 固液比對綠原酸提取率的影響

2.2.3 超聲波功率對綠原酸提取的影響 其它條件一定時,考察超聲波功率對提取效果的影響,結(jié)果見圖4：隨超聲波功率的增加,山銀花綠原酸提取率逐漸增大,當(dāng)超聲波功率達到300W時,山銀花綠原酸提取率達到最大值,超聲波功率繼續(xù)增大,山銀花綠原酸提取率反而降低。這可能與超聲波的空化效應(yīng)有關(guān),超聲波提取中可以產(chǎn)生很多的微泡,這些小空洞迅速膨大閉合,引起微粒間的劇烈撞擊,使液體局部溫度驟然增高,高溫使不穩(wěn)定的綠原酸的鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)被氧化分解從而使提取率有所下降[18-19]。為保證綠原酸的充分提取并避免化合物的分解以及節(jié)約能源,正交實驗設(shè)計中超聲波功率的設(shè)置為：250～350W。

2.2.4 超聲波頻率對山銀花綠原酸提取的影響 其它條件一定時,考察超聲波頻率對提取效果的影響,結(jié)果見圖5：室溫下相同時間內(nèi)使用超聲波方法的提取效率遠高于不使用者,隨超聲波頻率增加，山銀花綠原酸的提取率逐漸增加。這可能是由于超聲波所具有的機械效應(yīng)和溫?zé)嵝?yīng),使細胞振蕩、摩擦,并刺激細胞半透膜的彌散過程,超聲波的頻率越高分子震動的頻率越高,具有的能量越大,細胞內(nèi)物質(zhì)向外滲出的速度越快。同時由于超聲波具有的空化效應(yīng),產(chǎn)生很多的微泡,這些小空洞迅速的膨脹閉合,產(chǎn)生很好的攪拌作用,并能打碎細胞壁,加速綠原酸的向外溶出[18,20]。正交實驗設(shè)計中超聲波頻率的設(shè)置為40～59kHz。

圖4 超聲波功率對綠原酸提取的影響

圖5 超聲波頻率對綠原酸提取率的影響

2.3正交實驗優(yōu)化山銀花綠原酸提取工藝

按照表1的因素水平,采用L9(34)正交實驗方法,優(yōu)選山銀花綠原酸提取工藝(見表2),并對實驗結(jié)果進行了方差分析(見表3)。結(jié)果表明：提取時間(A)、固液比(B)、超聲波功率(C)、超聲波頻率(D)均對綠原酸的提取有極顯著的影響；各因素的優(yōu)先次序為D>B>C>A,即超聲波頻率>固液比>超聲波功率>提取時間。通過極差分析及單因素多重比較確定最佳的工藝組合為A3B3C2D3。

從表2中可知,9組實驗,提取效率最高的為實驗3(A1B3C3D3),采用正交優(yōu)選最佳工藝組合A3B3C2D3和A1B3C3D3兩種提取工藝組合進行提取,綠原酸提取率分別為：88.7624、83.2274mg/g。結(jié)果表明,通過極差分析得到的山銀花綠原酸的最佳提取工藝組合A3B3C2D3優(yōu)于正交設(shè)計中的A1B3C3D3。室溫下,溶劑為50%的乙醇(體積分數(shù)),超聲波輔助山銀花綠原酸提取的最佳工藝條件組合為：提取時間：50min,固液比：1∶50,超聲波功率：300W,超聲波頻率：59kHz。

2.4正交優(yōu)化組合穩(wěn)定性實驗

為驗證優(yōu)選工藝的可靠性及穩(wěn)定性,依上述優(yōu)選所得工藝條件進行5次平行實驗,經(jīng)檢測綠原酸提取率平均為88.7624mg/g,相對標準偏差RSD為1.28%。結(jié)果：綠原酸得率較高且穩(wěn)定性良好,適宜于生產(chǎn)應(yīng)用。

2.5不同產(chǎn)地山銀花的綠原酸含量檢測

采用正交優(yōu)選最佳工藝組合對不同產(chǎn)地山銀花綠原酸進行提取檢測,結(jié)果表明(見表4)：重慶秀山的灰氈毛忍冬和湖南隆回的灰氈毛忍冬系列品種(金翠蕾、湘銀翠蕾、白云)綠原酸含量明顯高于產(chǎn)自廣西上思的華南忍冬、貴州安龍的黃褐毛忍冬和廣西忻城的紅腺忍冬。

表2 正交實驗結(jié)果

表3 綠原酸正交實驗方差分析

注：F0.01(2,18)=6.01。

2.6山銀花提取液對DPPH自由基清除作用

如圖6中所示,抗壞血酸、綠原酸、山銀花提取液均對DPPH自由基有很好的清除效果。山銀花提取液和綠原酸標品在低濃度時對DPPH自由基的清除能力遠高于抗壞血酸,呈線性增長。山銀花提取液和綠原酸分別于濃度10、15μg/mL清除率達到90.22%和93.25%。在低濃度范圍時山銀花提取液對DPPH自由基的清除率高于綠原酸,這可能與金銀花提取液中所含黃酮類、酚類、皂苷類等化合物有關(guān)(如圖1所示),但濃度大于15μg/mL后,清除能力相當(dāng),表明在山銀花提取液中綠原酸是主要的抗氧化成分。

表4 不同產(chǎn)地山銀花綠原酸含量測定

圖6 山銀花提取液、抗壞血酸和綠原酸 對DPPH自由基的清除作用

2.7山銀花提取液對Fe3+還原作用

植物中含有多種抗氧化物質(zhì),可使Fe3+還原成Fe2+,通過比色法測定,在700nm處吸光度值越大,其還原能力越強。如圖7所示抗壞血酸具有較強的還原性,隨濃度增大抗壞血酸對Fe3+的還原能力逐漸增大。山銀花提取液和綠原酸在低濃度時,還原能力較差兩者相差不大。山銀花提取液濃度大于40μg/mL后,隨濃度的增大還原能力有大幅的增加。

圖7 山銀花提取液、綠原酸和抗壞血酸還原能力測定

3 結(jié)論與討論

本研究對超聲波輔助山銀花綠原酸的提取工藝組合進行了實驗,通過數(shù)據(jù)分析可知：提取時間、固液比、超聲波功率和超聲波頻率均對山銀花綠原酸提取有極顯著的影響,影響的大小依次為超聲波頻率>固液比>超聲波功率>提取時間；通過極差分析及單因素多重比較確定最佳的工藝組合為A3B3C2D3,即提取時間50min,固液比1∶50,超聲波功率300W,超聲波頻率59kHz。在此條件下綠原酸提取率達到88.7624mg/g。

山銀花綠原酸提取物具有一定的還原能力,且隨濃度增加還原能力有較大的增加。山銀花綠原酸提取液在低濃度時即表現(xiàn)較好的清除DPPH自由基的能力,當(dāng)濃度為10μg/mL時其清除率可達到90.22%。低濃度時的清除能力遠高于抗壞血酸。山銀花綠原酸提取液具有一定的還原能力和較好的清除DPPH自由基的能力,可作為抗氧化的功能性食品進行進一步開發(fā)利用。

植物有效成分的提取中,原料的粉碎度對提取有一定的影響,植物的次生有效成分,存在于細胞內(nèi),通過對原料的處理,使其顆粒變小,增加與溶劑的接觸面積,便于有效成分的提取[20-21]。本實驗中實驗原料為植物的花蕾,前期實驗發(fā)現(xiàn)原料20目即可很好的滿足實驗的需要,這可能與超聲波的強大穿透能力和機械效應(yīng)有關(guān)。雖然植物有效成分提取中,溫度也為非常重要的一個因子,但由于超聲波的空化效應(yīng)和熱效應(yīng)的存在,無法明確設(shè)定溫度對山銀花綠原酸提取率的影響,故本次未將其設(shè)定為參考因子。

超聲波提取技術(shù)工藝運行成本低,操作簡單易行,并且提取溫度低,可以保護有效成分。超聲波提取技術(shù)的運用可以大大提高山銀花綠原酸提取效率并且節(jié)約能源,具有推廣價值。山銀花綠原酸含量高,非常適合作為綠原酸工業(yè)化生產(chǎn)的原料,不同產(chǎn)地不同品種的山銀花綠原酸含量有一定的差異,在引種中應(yīng)選擇適應(yīng)當(dāng)?shù)貤l件的優(yōu)良品種進行發(fā)展。

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Optimization of ultrasonic-assisted extraction and antioxidant activity of chlorogenic acid fromLoniceramacranthoidesHand.-Mazz.

LIUYa-min1,2,LIUYu-min1,2,*,LIQiong3,SHANGYan-shuang1,2

(1.College of Resources and Environment,Southwest University,Chongqing 400715,China； 2. College of Life Sciences,Southwest University,Chongqing 400715,China; 3. College of Pharmaceutical sciences,Southwest University,Chongqing 400715,China)

The object of this research was to optimize ultrasonic-assisted extraction process of chlorogenic acid fromLoniceramacranthoidesHand.-Mazz. The chlorogenic acid was tested by HPLC. To maximize the extraction of chlorogenic acid,main technological parameters like ultrasonic extraction time,ethanol concentration,solid/liquid ratio and temperature,were investigated by single factor method coupled with L9(34)orthogonal array design. Results showed that the optimal conditions of extracting chlorogenic acid fromLoniceramacranthoideswas 50% ethanol,ultrasonic power 300W,ultrasonic frequency 59kHz,extracting 50min,with a solid/liquid ratio of 1∶50.Under above conditions,the extraction yield of chlorogenic acid reached 88.7624 mg/g. It was proved that this extracting technology was reasonable and feasible. The results demonstrated that extract fromLoniceramacranthoideshad certain reduction capacity and potent DPPH radical scavenging capacity and could be used as antioxidants and in functional foods.

LoniceramacranthoidesHande-Mazz.;chlorogenic acid;ultrasonic-assisted extraction;optimization

2013-06-17 *通訊聯(lián)系人

劉亞敏(1976-)，女，碩士，副教授，主要從事藥用植物資源利用方向的研究。

國家自然科學(xué)基金面上項目(31170546)；中央高?；緲I(yè)務(wù)費專項(XDJK2010C042)；國家林業(yè)局公益性行業(yè)科研專項(201004043)；西南大學(xué)生態(tài)學(xué)重點學(xué)科“211工程”建設(shè)項目。

TS201.1

：B

：1002-0306(2014)01-0186-06