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(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

豌豆粉絲廠廢水中蛋白質(zhì)的提取和性質(zhì)研究

師偉偉,華欲飛

(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

本論文以豌豆粉絲廠廢水中的蛋白為原料提取豌豆分離蛋白,通過對提取工藝進(jìn)行研究,確定了在pH12.0,固液比1∶20(g/mL),30℃下提取30min的提取條件,提取率達(dá)到62.25%。氨基酸分析結(jié)果表明,所提豌豆分離蛋白(PPI)氨基酸沒有遭到破壞,營養(yǎng)價值較高。通過對PPI功能性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn),除了吸水吸油性外,PPI的乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性都和大豆分離蛋白(SPI)接近。由此可見,PPI可以作為SPI的替代品應(yīng)用于食品,具有很大的實用價值。采用DSC研究了PPI的熱力學(xué)性質(zhì),在87.67℃(7S)和104.28℃(11S)有兩個峰,這可能是在堿溶酸沉過程中,蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定變化造成的。

廢水豌豆蛋白,豌豆分離蛋白,提取工藝,功能性質(zhì)

豌豆是我國重要的食用豆類之一,是具有糧食、蔬菜、飼料和醫(yī)藥等多種用途的作物。豌豆?fàn)I養(yǎng)豐富,富含淀粉(大于50%)、優(yōu)質(zhì)的蛋白(18%～30%)[1]、纖維素和礦物質(zhì),其中豌豆蛋白是一種營養(yǎng)均衡的蛋白,富含賴氨酸[2]。其氨基酸組成與FAO/WHO推薦的值較為接近。據(jù)有關(guān)資料報道,豌豆蛋白有較好的乳化性和起泡性,可作為大豆蛋白的一種潛在替代品。上述優(yōu)點使得對豌豆蛋白性質(zhì)的研究顯得更為重要。國外提取豌豆蛋白質(zhì)的方法主要有兩種,一是干法破碎,風(fēng)選。二是濕法提取,用鹽提取或者堿溶酸沉,超濾等方法[3]。在國內(nèi),豌豆主要應(yīng)用于粉絲的生產(chǎn)。這是因為豌豆淀粉中直鏈淀粉含量高,制成的粉絲光澤好,久煮不斷。在粉絲加工生產(chǎn)中,豌豆淀粉被有效的利用,蛋白質(zhì)卻隨著廢水被排放掉,造成了資源的極大浪費。只有少數(shù)生產(chǎn)廠家對廢水中的蛋白進(jìn)行簡單回收,回收出的蛋白也都用在飼料中[4],經(jīng)濟效益不高。本研究就是利用廢水中沉淀出的蛋白質(zhì),進(jìn)行進(jìn)一步提取,提高其中的蛋白含量,同時對其性質(zhì)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

豌豆蛋白粉原料 粉絲廠廢水蛋白回收自制；豌豆分離蛋白 自制；大豆分離蛋白 山東谷神；大豆油 金龍魚；鹽酸、氫氧化鈉、硫酸 均為分析純。

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司；KDN-08sx定氮消化爐 上海嘉定糧油儀器有限公司；HimacCR21GⅡ冷凍離心機 日立；LGJ-18型冷凍干燥機 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；Bluewave激光粒度分析儀 美國；K9840自動凱氏定氮儀 濟南海能儀器有限公司；Agilent 1100 series氨基酸自動分析儀 安捷倫科技有限公司；DSCQ2000型差示熱量掃描儀 TA公司。

1.2實驗方法

1.2.1 豌豆蛋白粉原料的制備 取一定量豌豆粉絲廠廢水,調(diào)節(jié)pH至5.0,使蛋白沉淀下來,然后3000r/min離心20min,棄上清,沉淀按固液比1∶20加 80%酒精進(jìn)行脫水處理。得到水分含量較低的豌豆蛋白粉原料,對其基本成分進(jìn)行分析。

表1 豌豆蛋白粉原料成分

基本成分分析：水分含量：GB/T 5497-1985；灰分含量的測定：GB 5009.4-2010；蛋白質(zhì)含量的測定：GB 5009.5-2010；脂肪含量的測定：GB/T 5009.6-2003。

1.2.2 豌豆分離蛋白的提取 參考U.D.Charan[5]的方法,稍作改變。取20g豌豆蛋白粉,按一定固液比加水,高速剪切使其充分溶解,用1mol/L的NaOH/HCl調(diào)pH至一定值,在一定溫度下浸提一定時間。然后4000g離心20min,上清用1mol/L的HCl調(diào)pH至4.5,4000g離心20min,沉淀用1∶2(w/v)水洗滌兩次。沉淀加水溶解,用1mol/L NaOH調(diào)pH至7.0,冷凍干燥。冷凍干燥后樣品即為豌豆分離蛋白。

蛋白提取率(%)=分離蛋白中蛋白總含量/原料中蛋白總量×100

式(1)

1.2.2.1 不同pH對提取率的影響 按上述方法提取分離蛋白,提取過程中控制固液比1∶20(g/mL),室溫,提取60min,研究不同pH對蛋白提取率的影響。

1.2.2.2 不同固液比對蛋白提取率的影響 按上述方法提取分離蛋白,提取過程中控制提取pH12.0,提取時間60min,室溫,研究不同固液比對蛋白提取率的影響。

1.2.2.3 不同提取時間對蛋白提取率的影響 按上述方法提取分離蛋白,提取過程中控制pH12.0,固液比1∶20(g/mL),室溫,研究不同提取時間對蛋白提取率的影響。

1.2.2.4 不同提取溫度對蛋白提取率的影響 按上述方法提取分離蛋白,提取過程中控制pH12.0,固液比1∶20(g/mL),提取時間30min,研究不同溫度對蛋白提取率的影響。

1.2.3 氨基酸分析 按照1.2.2中豌豆分離蛋白的提取方法,控制固液比1∶20(g/mL),提取溫度30℃,提取時間30min,分別在pH7.0和pH12.0下提取豌豆分離蛋白,對其進(jìn)行總氨基酸分析?？偘被岱治鰠⒖糋lenna J. Hughes[6]等的方法。稱取100mg樣品于消化管中,加入8mL 6mol/L鹽酸,至溶解,抽真空,封管,于116℃消化22h。消化完成后,轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中,定容,混勻,樣品用雙層濾紙過濾。取1mL濾液于25mL燒杯中,置于干燥器中蒸酸(干燥器中盛放NaOH固體)過夜。取出已蒸干25mL干燥后的小燒杯,加入1mL 0.02mol/L的HCl,靜置1h后,以玻璃棒攪拌后直接倒入1.5mL離心管內(nèi),10000r/min離心10min。取400μL至Agilent專用樣品瓶內(nèi),蓋好瓶蓋,標(biāo)記。樣品用氨基酸自動分析儀分析。

1.2.4 蛋白功能性質(zhì)的測定

1.2.4.1 溶解性的測定 稱取六組0.5g蛋白樣品,分別溶解于25mL去離子水中。調(diào)節(jié)這六組蛋白溶液的pH分別至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0,溶解30min后,3000r/min離心20min。用微量凱氏定氮法測定樣品中蛋白含量和不同pH下上清液中蛋白含量,NSI計算公式見式(2)。

NSI=上清液中蛋白質(zhì)總量/樣品中蛋白總量

式(2)

1.2.4.2 持水性測定 準(zhǔn)確稱取2.0g樣品分散于20mL水中,80℃水浴60min后,冷卻到30℃,3000r/min離心10min,測出上清液體積V(mL),持水性計算公式見式(3)。

式(3)

1.2.4.3 吸油性的測定 準(zhǔn)確稱取2.0g樣品置于離心管中,加入色拉油20mL,用玻璃棒攪拌1min,靜置30min后,用3000r/min,離心25min,測出游離油體積V(mL),吸油性計算公式見式(4)。

式(4)

1.2.4.4 起泡性的測定 參考RotimiE.Aluko[7]的方法略作改變,將一定量的樣品溶解于50mL水中,調(diào)pH至7.0,10000r/min下均質(zhì)2min,記錄均質(zhì)停止時泡沫的體積V(mL),起泡性FC計算公式見式(5)。

式(5)

分別記錄均質(zhì)停止后10、30、60min的泡沫體積V′(mL),用來衡量泡沫穩(wěn)定性。

式(6)

1.2.4.5 乳化性和乳化穩(wěn)定性測定 同上,參照Rotimi E. Aluko等的方法,稍作改變。配制蛋白濃度為1%(w/v)的蛋白溶液。取10mL大豆油加入50mL蛋白溶液中,10000r/min高速混勻2min,然后在40MPa壓力下均質(zhì)。用粒徑分析儀測定乳化液的粒徑。

1.2.5 熱力學(xué)性質(zhì) DSC測定：參考Andres Colombo等[8]的方法稍作改變。配制20%(w/v)濃度蛋白樣品,取10～15mg樣品于鋁盤中,密封鋁盤,從30℃到120℃以5℃/min速度升溫測定。實驗結(jié)果采用The universal analysis2000軟件分析,計算蛋白的變性溫度(Td)和變性焓變(ΔH)。

2 結(jié)果與討論

2.1豌豆蛋白粉原料成分測定

首先對廢水中制得的豌豆蛋白粉原料的成分進(jìn)行測定,實驗結(jié)果見表1。

由表1可以看出,原料的蛋白含量較高,但是由于含有較高的淀粉和脂質(zhì),功能性質(zhì)較差。在商業(yè)生產(chǎn)中,這種蛋白主要是應(yīng)用于飼料中,經(jīng)濟價值較低。因此,以這種蛋白粉為原料通過堿溶酸沉,制備功能性質(zhì)較高的分離蛋白,從而提高其應(yīng)用范圍和經(jīng)濟價值具有重要的意義。

2.2豌豆分離蛋白提取工藝的研究

2.2.1 不同pH對提取率的影響 結(jié)果見圖1。

圖1 pH對提取率的影響

由圖1可以看出,隨著pH的升高,蛋白質(zhì)的提取率提高。在pH小于10時,隨著pH的升高,提取率升高的幅度較慢。在pH11.0,pH12.0時蛋白提取率升高的幅度較大,在pH12.0時有一個明顯的升高,提取率達(dá)到62.74%。但是pH12已經(jīng)是堿性較強的環(huán)境,繼續(xù)增加pH可能對蛋白的性質(zhì)產(chǎn)生不良影響,風(fēng)險較大。因此,綜合各方面因素考慮,選用pH12.0做以后研究。本實驗結(jié)果和沙金華等人[9]得到的結(jié)果相比較低,原因可能是,沙金華采用的是直接由豌豆提取得到分離蛋白,而本實驗采用的原料為粉絲廠廢水中的蛋白,經(jīng)過了一定的處理,蛋白和淀粉、纖維、脂質(zhì)等結(jié)合的比較緊密,更難以溶出,導(dǎo)致提取率很難提高。

2.2.2 不同固液比對蛋白提取率的影響 結(jié)果見圖2。

圖2 不同固液比對蛋白提取率的影響

由圖2可以看出隨著固液比的升高,蛋白與水作用的更加充分,提取率提高。在固液比1∶20(g/mL)時,繼續(xù)增加固液比提取率幾乎不變。因此,選用固液比1∶20做以后研究。

2.2.3 不同提取時間對蛋白提取率的影響 結(jié)果見圖3。

圖3 不同提取時間對蛋白提取率的影響

由圖3知,隨著時間的延長,蛋白提取率逐漸升高。但是為了避免高堿下蛋白發(fā)生“賴丙”反應(yīng)產(chǎn)生有毒物質(zhì),故采用30min作為后續(xù)提取時間。

2.2.4 不同提取溫度對蛋白提取率的影響 結(jié)果見圖4。

圖4 不同溫度對蛋白提取率的影響

由圖4可以看出,隨著溫度的升高,蛋白提取率提高,這是因為溫度加速了堿和蛋白的相互作用使蛋白更容易被提取出來。但是由于溫度過高容易生成有毒物質(zhì),為了避免這種情況的發(fā)生,同時考慮到高溫能耗多,成本高,綜合考慮選用30℃為提取溫度。

綜合上述實驗結(jié)果,可以看出pH是影響提取率的最顯著的因素。綜合產(chǎn)品的蛋白提取率和營養(yǎng)價值考慮,選用在固液比1∶20(g/mL),pH12.0,30℃,條件下提取30min作為蛋白的最終提取條件。在此條件下進(jìn)行重復(fù)性實驗對結(jié)果進(jìn)行驗證,所得蛋白的平均提取率為62.25%。

2.3豌豆分離蛋白氨基酸分析

以豌豆蛋白粉為原料,分別對pH7.0和pH12.0下所提得的分離蛋白進(jìn)行氨基酸分析,結(jié)果見表2。

由表2可以看出,pH12.0提取的分離蛋白,氨基酸組成和在pH7.0下提取的變化不大。用SPSS 19.0軟件分析,p>0.05,二者差別不顯著,在誤差范圍內(nèi)。而對堿敏感的幾種氨基酸如絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸、半胱氨酸、賴氨酸的含量也沒有明顯的降低。說明高堿短時的提取并沒有造成氨基酸的破壞,同時可以看出豌豆分離蛋白的營養(yǎng)價值很高,具有很高的應(yīng)用價值。

表3 吸水性、吸油性、起泡性、乳化性分析

2.4蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的測定

2.4.1 溶解性 溶解性是蛋白質(zhì)的一個重要的理化性質(zhì),與pH、離子強度、溫度、溶劑極性及處理過程有關(guān)。它在一定程度上表征了蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)如乳化性、起泡性、凝膠性等。豌豆分離蛋白的溶解性見圖5。

表2 氨基酸組成分析(g/100g蛋白)

圖5 溶解度隨pH的變化

由圖5可以看出,在pH2.0時,豌豆蛋白粉原料,SPI,PPI的溶解度分別為68.27%,60.21%,47.20%。豌豆蛋白粉原料比SPI和PPI的溶解度要高,這可能是因為原料沒有經(jīng)過處理,也沒有經(jīng)過堿溶酸沉,故蛋白質(zhì)幾乎沒有變性,溶解度高。從整體來看,三種蛋白在pH4和pH6溶解度較低,這是因為豌豆蛋白和大豆蛋白的等電點在4.5,在等電點附近蛋白所帶的凈電荷為0,溶解度低。在pH小于4.0和pH大于6.0時,此時離蛋白的等電點較遠(yuǎn),蛋白質(zhì)本身帶的靜電荷增加,三種蛋白溶解度都升高,在高堿下蛋白溶解度較高。曲線變化與豆類植物的溶解度趨勢相符。SPI在整個pH范圍內(nèi)的溶解度都高于PPI,Tomoskozi[10]等人也得到了相似的結(jié)果。

2.4.2 吸水性、吸油性、起泡性、乳化性測定 吸水性、吸油性、起泡性等性質(zhì)是蛋白的重要性質(zhì)。從表2可以看出PPI的各方面性質(zhì)比豌豆蛋白原料有較大提高。與SPI相比,PPI吸水吸油性略差。這是因為SPI是來自商業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用于肉制品中的蛋白,經(jīng)過了一定的改性,功能性較好。即便如此,PPI的其它性質(zhì)都和SPI接近,甚至比SPI的性質(zhì)更好(如起泡性)。這個結(jié)果也說明,豌豆分離蛋白可以作為大豆分離蛋白的替代,應(yīng)用在食品中。

2.5熱力學(xué)性質(zhì)研究

蛋白質(zhì)的DSC(差示熱量掃描)測定能夠反映蛋白的熱力學(xué)性質(zhì)。圖6～圖8給出了豌豆蛋白粉原料、PPI、SPI的DSC圖譜,在表4中對三者的的熱變性溫度和焓變值進(jìn)行了總結(jié)。從表中可以看出,豌豆蛋白粉原料在86.79℃左右(7S和11S峰重合)有一個較大的吸熱峰,這和P.J. Shand的報道[11]相似,P.J. Shand在86℃檢測到了豌豆蛋白的一個熱吸收峰。從表4看出,在PPI中有兩個吸熱峰,分別在87.87℃(7S)和104.28℃(11S),結(jié)果比Han-Ni Liang[12]等人測得部分純化的7S(83.2℃),11S(92.3℃)要高,這可能是因為在堿溶酸沉過程中蛋白發(fā)生了部分變性。在對照SPI中,由于7S的熱吸收峰較弱,只在93.62℃檢測到一個11S的吸收峰。

表4 豌豆蛋白粉原料,PPI,SPI的 熱變性溫度(Td)和焓變(ΔH)

圖6 豌豆蛋白粉原料的DSC圖譜

圖7 PPI的DSC圖譜

圖8 SPI的DSC圖譜

3 結(jié)論

pH是影響豌豆分離蛋白提取最顯著的因素,在pH升高的過程中蛋白提取率顯著上升,因此采用pH12作為提取條件,蛋白提取率達(dá)到了62.25%。氨基酸分析證明,在此條件下得到的豌豆分離蛋白氨基酸沒有遭到破壞,具有很高的營養(yǎng)價值。

通過研究豌豆分離蛋白的功能性質(zhì)發(fā)現(xiàn),豌豆分離蛋白的溶解度、吸水性和吸油性比大豆分離蛋白差,起泡性和泡沫穩(wěn)定性比大豆分離蛋白好,乳化性和乳化穩(wěn)定性與大豆蛋白相似,可以作為大豆分離蛋白的一種替代品。

通過DSC研究了豌豆分離蛋白的熱力學(xué)性質(zhì),檢測到兩個峰分別在87.87℃(7S)和104.28℃(11S),比資料報道略高,可能是在堿溶酸沉過程中,

蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定變化。

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Protein isolation from bean vermicelli waste water and characterization

SHIWei-wei,HUAYu-fei

(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The pea protein isolate(PPI)was isolated from the waste water of bean vermicelli factory. Through the study of extraction process,the extraction condition was finally set. The condition was extract at pH12.0,solid-liquid ratio 1∶20(g/mL),30℃ for 30min. In this method,the extraction rate finally reached 62.25%. Total amino acids analysis indicated that the amino acids had not been destroyed through processing,the result showed that PPI had a high nutritional value. Physicochemical and functionality of PPI and soy protein isolate(SPI)were compared and analyzed. Except oil and water absorption capability,the functionality of PPI was similar to SPI,such as foaming and emusifying capability. So PPI can be used as a subsititute for SPI. Through the differential scanning calorimetry(DSC),two endothermic peak were found,one of them was at 87.67℃ for vicilin and the other was at 104.28℃ for legumin. This may be due to the change of protein structure in the isolate procedure.

waste water protein;pea protein isolate;extraction process;functionality

2013-06-03

師偉偉(1990-)，女，碩士，研究方向：植物油脂與蛋白。

TS209

：A

：1002-0306(2014)01-0120-05