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(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東湛江 524088； 2.旭駿水產(chǎn)(湛江)有限公司,廣東湛江 524057)

不同組分馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯對(duì)人肺癌細(xì)胞A549作用的研究

蔡璐1,王維民1，*,諶素華1,丁偉2,李春蓮1

(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東湛江 524088； 2.旭駿水產(chǎn)(湛江)有限公司,廣東湛江 524057)

本研究采用不同組分馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯(SF)對(duì)人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞的抑制作用進(jìn)行了研究。根據(jù)MTT比色法檢測(cè)不同細(xì)胞鋪板數(shù)量及不同質(zhì)量濃度SF對(duì)該細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響；不同組分SF在不同時(shí)間對(duì)該細(xì)胞的增殖抑制率；倒置顯微鏡下觀察SF對(duì)該細(xì)胞形態(tài)的影響。研究結(jié)果表明,當(dāng)SF的濃度在1～25mg/mL范圍、細(xì)胞鋪板數(shù)量為5×103個(gè)/mL時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)曲線線性良好；各組分SF對(duì)人肺癌細(xì)胞A549均有抑制作用,其中SF2-R對(duì)細(xì)胞的抑制效果較強(qiáng),抑制率為61.06%。

馬尾藻巖藻聚糖,人肺癌細(xì)胞A549,抑制效果,鋪板

馬尾藻(Sargassumsiliquastrum)是褐藻的一屬,墨角藻目、馬尾藻科、馬尾藻屬。巖藻聚糖硫酸酯(Fuciodan)是海藻多糖中一類獨(dú)特的結(jié)合有硫酸基團(tuán)的活性多糖,具有顯著的抗腫瘤[1-2]、抗病毒[3-4]、提高免疫力[5]、降血脂[6-7]、抗凝血[8]等活性。但由于其分子量大,溶解性較差,不容易被人體吸收,所以在研究和應(yīng)用方面受到了限制。因此研究低分子量的巖藻聚糖硫酸酯的制備及其活性為巖藻聚糖的應(yīng)用開拓了新的途徑。目前關(guān)于海帶[9](Laminaria)、裙帶菜[10](Undariapinnatifida)、鼠尾藻[11](Sargassum.thunbergii)等褐藻中提取的巖藻聚糖硫酸酯的抗腫瘤活性已經(jīng)有了很多的研究報(bào)道,但是對(duì)馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯尤其是低分子量的馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯的研究很少。本文以馬尾藻為原料提取SF,經(jīng)分解得到不同分子量的組分,研究不同組分SF對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的抑制作用,希望能夠?qū)F作為對(duì)肺癌進(jìn)行抑制的功能性食品提供依據(jù),并為馬尾藻的綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

馬尾藻 2012年4月采自湛江硇州島；不同分子量的SF 由本實(shí)驗(yàn)室提取、分離純化及降解所得8個(gè)組分,其相對(duì)平均分子量及硫酸根含量如下：SF1(851.13ku,30.93%)、SF2(239.05ku,32.65%)、SF3(102.34ku,29.88%)、SF4(19.95ku,21.61%)、SF1-R(53.74ku,33.63%)、SF2-R(19.54ku,35.87%)、SF3-R(9.27ku,30.44%)、SF4-R(6.69ku,20.85%)。

細(xì)胞株：人肺癌細(xì)胞A549 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命院細(xì)胞資源中心；RPMI-1640培養(yǎng)基 美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品；胰蛋白酶Trypsin 美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品；噻唑藍(lán)(MTT) 美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品；青霉素G鈉鹽 美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品；硫酸鏈霉素 美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品；優(yōu)級(jí)胎牛血清 杭州四季青生物工程有限公司生產(chǎn)；二甲基亞砜DMSO 美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品；PBS緩沖液(pH7.2～7.4) 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

SHELL/JB TC2323型CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)殼牌公司；BHC-1300ⅡA/B3型超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司；TE300型倒置顯微鏡 NIKEO ECLIPSE公司；BIO-ELX808型全自動(dòng)酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；TG16A-WS型離心機(jī) 上海離心機(jī)儀器有限公司；液氮罐 成都云光低溫科技有限責(zé)任公司；Thermo超低溫冰箱 廣州市凌志電子科技有限公司；高壓滅菌鍋 上海比朗儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市達(dá)北實(shí)驗(yàn)儀器廠；AUW120型電子分析天平 日本島津；PHS-3C精密pH計(jì) 上海雷磁。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng) 將肺癌細(xì)胞A549以RPMI-1640為培養(yǎng)液(含10%小牛血清、青霉素100U/L、鏈霉素100μg/L),在5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),以0.25%的胰蛋白酶消化,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 腫瘤細(xì)胞鋪板數(shù)量的確定 以細(xì)胞計(jì)數(shù)法建立肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)曲線,將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,按1×103～1×105個(gè)/mL 180μL接種到培養(yǎng)板各孔中,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72、96h后加入20μL MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄培養(yǎng)液加入150μL DMSO,振蕩10min,490nm測(cè)OD值。以培養(yǎng)時(shí)間(h)為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,對(duì)比不同鋪板數(shù)量的細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間的生長(zhǎng)曲線的線性情況。

1.2.3 多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用的濃度確定 研究一系列不同質(zhì)量濃度(0、0.1、0.5、1、2、4、8、10、15、20、25、30mg/mL)的多糖對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖的抑制情況。以MTT法測(cè)定SF1對(duì)細(xì)胞作用48h后細(xì)胞數(shù)量反應(yīng)的OD值與濃度之間的關(guān)系。

1.2.4 MTT比色法測(cè)定各組分SF對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響 參照文獻(xiàn)[12]將生長(zhǎng)情況良好的肺癌細(xì)胞A549濃度調(diào)整為5×103個(gè)/mL,每孔180 μL接種于96孔板上,每孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)對(duì)照孔和空白孔,在37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)24h；在96孔板中每孔加入20uL用RPMI-1640培養(yǎng)基配制的不同質(zhì)量濃度的多糖溶液,使多糖的最終濃度調(diào)整為1、2.5、5、10、20mg/mL的,在對(duì)照組和空白組加入20μL的RPMI-1640培養(yǎng)基；使多糖溶液作用的時(shí)間分別為24、48、72h,作用時(shí)間結(jié)束后,倒掉上清液,用PBS洗滌2次；每孔加入用濾器過濾的MTT 20μL,在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h,小心吸除上清液,每孔加入150μL DMSO,將96孔板在酶標(biāo)儀上振蕩10min,490nm處檢測(cè)吸收值,計(jì)算：

增殖抑制率(%)=1-(處理組平均OD值-空白對(duì)照組平均OD值)/(對(duì)照組平均OD值-空白對(duì)照組平均OD值)×100。

按改良Karber公式計(jì)算半數(shù)抑制率(IC50)：

lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)[13]

式中符號(hào)意義：Xm：lg最大劑量,I：lg(最大劑量/相臨劑量),P：陽(yáng)性反應(yīng)率之和,Pm：最大陽(yáng)性反應(yīng)率,Pn：最小陽(yáng)性反應(yīng)率。

2 結(jié)果與分析

2.1腫瘤細(xì)胞鋪板數(shù)量的確定

將貼壁細(xì)胞A549按每孔細(xì)胞數(shù)量在1×103～1.0×105個(gè)/mL的范圍鋪板,繪制OD值與時(shí)間關(guān)系曲線,如圖1,當(dāng)細(xì)胞數(shù)量以5×103個(gè)/mL鋪板時(shí),細(xì)胞數(shù)量反應(yīng)的OD值與時(shí)間呈良好的線性關(guān)系(R=0.996)。當(dāng)鋪板細(xì)胞數(shù)少于1×103個(gè)/mL時(shí),結(jié)果重復(fù)性不好；當(dāng)細(xì)胞數(shù)量在5×104個(gè)/mL時(shí),在72h出現(xiàn)平臺(tái)期,細(xì)胞數(shù)量所反應(yīng)的OD值與時(shí)間的線性相關(guān)性不好。為了排除細(xì)胞數(shù)量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,對(duì)于肺癌細(xì)胞A549的后期實(shí)驗(yàn)宜選取5×103個(gè)/mL為鋪板數(shù)量。

圖1 不同接種數(shù)量的肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)曲線

2.2 SF對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用濃度確定

結(jié)果如圖2所示,與空白對(duì)照管比較,當(dāng)SF1濃度小于0.5mg/mL時(shí)測(cè)得的OD值與空白對(duì)照管OD接近,細(xì)胞增殖抑制作用不明顯。當(dāng)SF1濃度大于1mg/mL時(shí),細(xì)胞增殖被抑制,并且隨著SF1濃度的升高,細(xì)胞增殖抑制作用逐漸加劇。當(dāng)SF1濃度到達(dá)25mg/mL,細(xì)胞增殖抑制達(dá)到極限,繼續(xù)增加SF1濃度,細(xì)胞增殖的抑制情況變化不明顯。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,硫酸酯多糖的濃度在1～25mg/mL范圍內(nèi),對(duì)腫瘤細(xì)胞具有良好的抑制趨勢(shì),在后期實(shí)驗(yàn)中選取0(對(duì)照)、1.25、2.5、5、10、20mg/mL濃度進(jìn)行研究。

2.3各SF組分對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

時(shí)間(h)濃度(mg/mL)SF1SF1-RSF2SF2-ROD值IR(%)OD值IR(%)OD值IR(%)OD值IR(%)2400.567±0.0061.250.542±0.009*4.070.549±0.006**3.170.541±0.007**4.580.529±0.008**6.702.50.528±0.012**6.550.526±0.006**7.230.514±0.007**9.350.506±0.006**10.7650.495±0.019**12.390.482±0.013**14.990.485±0.015**14.460.467±0.009**#17.64100.488±0.009**13.630.472±0.004**16.750.470±0.015**17.110.446±0.009**##21.34200.481±0.017**15.610.464±0.007**18.170.456±0.005**19.580.423±0.013**##25.404800.768±0.0191.250.731±0.034**4.280.714±0.032**#7.030.717±0.009**6.640.704±0.014**8.332.50.698±0.005**9.110.682±0.005**#11.200.686±0.013**10.680.668±0.012**##13.0250.652±0.005**15.100.630±0.018**##17.980.646±0.010**15.880.615±0.006**#19.92100.609±0.011**20.700.583±0.025**##24.220.594±0.008**22.660.575±0.007**25.13200.542±0.012**29.430.518±0.015**##32.550.524±0.008**31.770.496±0.006**#35.427200.945±0.0161.250.853±0.014**9.770.869±0.013**8.040.841±0.008**11.010.826±0.015**#12.592.50.795±0.014**15.870.774±0.007**#18.180.782±0.005**17.250.762±0.006**#19.3750.690±0.017**26.980.647±0.008**##31.530.684±0.006**27.620.614±0.016**##35.03100.582±0.007**38.410.520±0.011**##44.970.564±0.017**40.310.493±0.012**##47.83200.451±0.008**47.720.398±0.009**##57.880.427±0.013**54.810.368±0.008**##61.06

注釋：降解前多糖組分與對(duì)照組比較：*p<0.05,**p<0.01；同濃度,同時(shí)間下降解后多糖組分與降解前多糖組分比較：#p<0.05,##p<0.01，表2同。

時(shí)間(h)濃度(mg/mL)SF3SF3-RSF4SF4-ROD值IR(%)OD值IR(%)OD值IR(%)OD值IR(%)2400.567±0.0061.250.555±0.0112.120.549±0.0113.170.557±0.0101.760.547±0.007*3.532.50.543±0.013*4.230.530±0.017**6.530.547±0.008*3.530.542±0.013**4.4150.505±0.014**10.930.502±0.005**11.460.531±0.072**6.350.529±0.005**6.70100.492±0.005**13.230.482±0.012**14.990.513±0.011**9.520.508±0.004**10.41200.485±0.006**14.460.479±0.018**15.520.496±0.004**12.520.501±0.009**11.644800.768±0.0191.250.739±0.016*3.780.728±0.015**5.210.745±0.018*2.990.750±0.010*2.302.50.724±0.005**5.730.707±0.004**#7.940.730±0.013**4.950.732±0.004**4.4950.679±0.009**11.590.667±0.006**13.150.703±0.025**8.460.72±0.002**#6.12100.638±0.010**16.930.607±0.015**##20.960.682±0.015**11.210.686±0.006**10.63200.584±0.012**23.960.571±0.005**25.650.643±0.014**16.280.641±0.010**16.547200.945±0.0161.250.896±0.036**5.190.877±0.014**#7.200.894±0.031*5.360.899±0.016**4.872.50.823±0.005**12.490.798±0.033**##15.560.870±0.016**7.940.878±0.012**7.0950.729±0.007**22.860.689±0.029**##27.090.812±0.010**14.070.831±0.021**12.06100.647±0.016**31.530.627±0.014**##33.650.746±0.015**21.060.768±0.014**18.73200.574±0.027**39.260.523±0.036**##44.660.684±0.029**27.620.693±0.012**26.67

MTT結(jié)果分析如表1、表2所示,不同質(zhì)量濃度的各組分SF對(duì)肺癌細(xì)胞A549作用不同時(shí)間后,細(xì)胞受到不同程度的抑制,而且不同時(shí)間、不同濃度的作用效果具有顯著性差異。相同作用時(shí)間下,隨著SF質(zhì)量濃度的增大,細(xì)胞增殖的抑制率逐漸升高,而在同一濃度水平,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),各組分SF對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用也呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì),可以看出各組分SF對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖的抑制作用呈現(xiàn)明顯的量效和時(shí)效關(guān)系。

表3 各SF組分對(duì)肺癌細(xì)胞A549作用不同時(shí)間的IC50值

圖2 肺癌細(xì)胞A549在不同濃度SF1作用下的生長(zhǎng)曲線

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(p<0.05顯著,p<0.01極顯著),8個(gè)組分SF對(duì)肺癌細(xì)胞A549作用的實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組的比較,結(jié)果分析表明：除1.25mg/mL組的SF3、SF3-R、SF4對(duì)細(xì)胞作用24h時(shí)的抑制作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(p>0.05),其余組與陰性對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05顯著,p<0.01極顯著)。在相同時(shí)間、相同濃度下,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析酶降解后的4個(gè)組分SF與其各自降解前組分對(duì)肺癌細(xì)胞A549的抑制作用結(jié)果表明：在48～72h,SF1-R、SF2-R相較于SF1、SF2對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制作用差異顯著(p<0.05顯著,p<0.01極顯著),在24h,個(gè)別濃度的SF2-R相較于SF2對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用差異顯著；在作用72h時(shí),SF3-R相較于SF3對(duì)A549細(xì)胞抑制作用差異顯著(p<0.05顯著,p<0.01極顯著),而在作用24、48h時(shí)只有個(gè)別濃度的SF3-R對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用相較于SF3差異顯著；SF4-R相較于SF4作用差異不顯著(p>0.05),具體結(jié)果分析如表1、表2。其中SF2-R對(duì)肺癌細(xì)胞A549作用72h時(shí)的抑制作用最明顯,抑制率達(dá)到61.06%,而SF4和SF4-R抑制作用接近且最低。這主要與各組分馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯的理化組成及分子量的大小有關(guān),海藻多糖的生物活性是在一定的分子量范圍體現(xiàn)出來的,分子量太大、太小都會(huì)影響其生物活性。在一定分子量范圍,經(jīng)酶降解的高分子量的馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯的活性被提高,但是分子量太低其活性也受到抑制。另外,活性硫酸基團(tuán)越多活性表現(xiàn)也越明顯。

2.4 SF對(duì)腫瘤細(xì)胞的IC50值

各組分SF對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖均有一定的抑制作用,而且不同濃度,不同作用時(shí)間對(duì)肺癌細(xì)胞A549抑制效果不同。通過抑制率對(duì)各組分SF濃度回歸方程計(jì)算在24、48、72 h不同時(shí)間組8個(gè)組分SF對(duì)肺癌細(xì)胞A549的IC50值如表3。作用72h時(shí),SF2-R對(duì)A549的IC50達(dá)到8.75mg/mL,低于其他SF組分對(duì)肺癌細(xì)胞A549的IC50。

3 結(jié)論

本文研究了不同細(xì)胞鋪板數(shù)量及不同質(zhì)量濃度的SF對(duì)肺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)曲線的影響,結(jié)果表明肺癌細(xì)胞A549鋪板數(shù)量在5×103個(gè)/mL時(shí)的OD值與時(shí)間的線性關(guān)系較好,當(dāng)SF的濃度為1～25mg/mL范圍時(shí),細(xì)胞增殖抑制作用隨著SF濃度的增加而增加；由MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,各組分SF對(duì)肺癌細(xì)胞A549均有一定的抑制作用,而且呈現(xiàn)一定的劑量和時(shí)間依賴性；通過各組分SF對(duì)腫瘤細(xì)胞作用72h的抑制作用比較,SF2-R表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制作用,抑制率達(dá)61.06%,SF4-R對(duì)肺癌細(xì)胞A549的抑制作用最弱,抑制率只有26.67%；通過抑制率對(duì)SF濃度的回歸方程計(jì)算,得出各組分對(duì)肺癌細(xì)胞A549作用72h的IC50值分別為：11.64、9.86、10.63、8.75、14.37、12.62、18.71、20.27mg/mL。

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Effect of different components of fucoidan fromSargassumsiliquastrumon Lung Cancer A549 Cells

CAILu1,WANGWei-min1，*,CHENSu-hua1,DINGWei2,LIChun-lian1

(1.College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China; 2.Xujun Aquatic Products Limited Company,Zhanjiang 524051,China)

In this study,the effect of sargasso fucosan sulfate(SF)with different components on inhibition of human lung cancer A549 cells was studied. The effect of different cell counts in the planking and SF with different concentrations on cell growth curve was detected according to the MTT assay;the proliferation inhibition rate of SF with different components on this cell at different times;the effect of SF on morphology of this cell was observed under an inverted microscope. The results showed that,when concentration of SF was set in the range of 1～25mg/mL,cell count in the planking was 5×103cell/mL,the cell growth curve had a good linearity;SF with different components all had inhibitory effect on human lung cancer A549 cells,in which SF2-R had the strongest inhibitory effect on the cells,and the inhibition rate was 61.06%.

fucoidan fromSargassumsiliquastrum;Lung Cancer A549 Cells;inhibitory effect;planking

2013-04-22 *通訊聯(lián)系人

蔡璐(1989-)，女，碩士在讀，研究方向：食品加工與貯藏。

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011B20310010)。

TS254.9

：A

：1002-0306(2014)01-0116-05