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(鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450002)

凍藏時間對麥谷蛋白和麥醇溶蛋白二級結(jié)構(gòu)及面團(tuán)性能的影響研究

李學(xué)紅，胡鐘毓，陸勇，荊曉燕，劉延奇

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450002)

分別對小麥醇溶蛋白和麥谷蛋白在-18℃下凍藏0～28d后其巰基和二硫鍵含量以及二級結(jié)構(gòu)的變化情況進(jìn)行研究，并分析了變化可能的內(nèi)在機(jī)理；進(jìn)一步探討了凍藏導(dǎo)致的面團(tuán)質(zhì)構(gòu)變化與兩種面筋蛋白結(jié)構(gòu)變化的對應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明：凍藏處理使麥醇溶蛋白和麥谷蛋白中巰基含量增加、二硫鍵含量減少，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量下降，β-折疊結(jié)構(gòu)含量升高；其中，凍藏處理對麥谷蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響程度要明顯大于麥醇溶蛋白。質(zhì)構(gòu)研究結(jié)果表明：兩種蛋白質(zhì)中二硫鍵、α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量的減少，對凍藏后面團(tuán)粘性、彈性、硬度的降低有著重要影響。

麥谷蛋白，麥醇溶蛋白，結(jié)構(gòu)，凍藏，質(zhì)構(gòu)

隨著冷凍面團(tuán)技術(shù)應(yīng)用的日益廣泛，對其的研究也越發(fā)深入，但到目前為止，仍有一些問題沒有得到很好解決。例如速凍和凍藏處理導(dǎo)致的面團(tuán)品質(zhì)下降就是其中之一。研究已經(jīng)表明，面團(tuán)烘焙制品的感官品質(zhì)與凍藏處理后面團(tuán)的面筋蛋白結(jié)構(gòu)變化有關(guān)[1]，凍藏使自由水結(jié)晶，從而破壞面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使烘焙面制品質(zhì)量下降。而麥谷蛋白和麥醇溶蛋白是面筋蛋白的主要組成部分，面筋蛋白的結(jié)構(gòu)變化也由這兩種蛋白結(jié)構(gòu)變化決定。所以小麥醇溶蛋白和麥谷蛋白對面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和冷凍面團(tuán)的質(zhì)量有著重要影響。Yuthana Phimolsiripol、劉國琴等人研究低溫對面團(tuán)、面筋蛋白分子結(jié)構(gòu)的影響[2-3]，但凍藏對面筋蛋白的重要組成部分——麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的結(jié)構(gòu)影響卻鮮見報道。本文就凍藏時間對小麥醇溶蛋白和麥谷蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行了研究，分析了凍藏處理后這兩種蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化以及可能的內(nèi)在機(jī)理，并將之與同樣冷凍處理后的面團(tuán)質(zhì)構(gòu)性能的變化相印證，從而得出凍藏導(dǎo)致的麥谷蛋白和麥醇溶蛋白結(jié)構(gòu)的變化對面團(tuán)品質(zhì)的影響，為提高冷凍面團(tuán)品質(zhì)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

甘氨酸、Tris、EDTA、濃鹽酸、5,5，-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)、脲、鹽酸胍、三氯乙酸 分析純；面粉 鄭州金苑面粉有限公司，特一粉。

雙波長紫外可見分光光度計 上海奧譜勒儀器有限公司；磁力攪拌器 江蘇中大儀器廠；真空干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；高速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；IR7650型傅里葉紅外光譜儀 上海分析儀器廠；TA-XTplus物性測試儀 Stable Micro System；凝膠過濾層析柱 上?？等A生化儀器制造廠；BSZ-100自動部份收集器 上海滬西分析儀器廠；紫外檢測儀 上海滬西儀器廠。

1.2實(shí)驗方法

1.2.1 樣品處理 取500g的面粉，加水洗去淀粉成為濕面筋蛋白備用(含水量約為50%)。

取部分上述濕面筋(不隔絕空氣)在27℃，-100kPa下真空常溫干燥18h后得面筋蛋白粉，再從中提取出麥醇溶蛋白和麥谷蛋白進(jìn)行巰基和二硫鍵的測定以及紅外光譜分析。

取余下濕面筋(不隔絕空氣)先在-40℃下速凍40min，然后在-18℃下凍藏7～28d，然后在27℃，-100kPa下真空常溫干燥18h后得面筋蛋白粉，再提取兩種蛋白質(zhì)分別進(jìn)行巰基和二硫鍵的測定以及紅外光譜的分析。

1.2.2 麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的提取及純度分析 取一定量的面筋蛋白粉按1∶35(m/v)的比例加入72%的乙醇，充分混勻后磁力攪拌2h，然后在4000r/min條件下離心20min。提取上清液在50～60℃條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，取出固體然后在27℃，-100kPa下真空常溫干燥10h即得麥醇溶蛋白；將離心后提出的固體直接進(jìn)行在27℃，-100kPa下真空常溫干燥6h即為麥谷蛋白[4-7]。

利用柱層析對提取的兩種蛋白質(zhì)進(jìn)行純度分析。層析介質(zhì)：葡聚糖凝膠G-100、柱子尺寸：1.6cm(直徑)×1m、洗脫液：麥醇溶蛋白：0.02mol/L的醋酸溶液，pH4.5；麥谷蛋白：0.05mol/L Tris-HCl，0.1mol/L KCl，pH7.5。

1.2.3 蛋白質(zhì)巰基和二硫鍵的測定 首先配制好Tris-甘氨酸緩沖液、Ellman’s試劑、脲溶液、脲+鹽酸胍溶液[8]。將15mg麥醇溶蛋白或麥谷蛋白樣品加入到1mL Tris-甘氨酸緩沖液中，充分混勻后再加入4.7g固體鹽酸胍，然后用緩沖液定容至10mL待用。

巰基的測定：取定容后1mL溶液加0.05mL Ellman’s試劑以及4mL脲-鹽酸胍溶液，在412nm處測定吸光度并做平行實(shí)驗取平均值。

二硫鍵的測定：取定容后1mL溶液加入4mL脲-鹽酸胍溶液以及0.05mL二巰基乙醇，將其在25℃水浴下保溫1h，繼續(xù)加入10mL 12%的三氯乙酸后，再于25℃水浴下保溫1h，在3000r/min下離心10min，再用5mL 12%三氯乙酸清洗沉淀物，最后將沉淀溶于10mL 8mol/L的脲溶液中，加0.04mL Ellman’s試劑，在412nm處測吸光度并做平行實(shí)驗取平均值[9-10]。

巰基、二硫鍵計算公式：

巰基(SH，μmol/g)=73.53A412×D/C，其中A412是所測的吸光值，C是樣品濃度，本實(shí)驗即為15mg/mL，D為稀釋因子，計算巰基時取5.02，計算總巰基時取10。二硫鍵的量即為總巰基數(shù)減去巰基數(shù)。

1.2.4 兩種蛋白質(zhì)的紅外光譜分析 對凍藏處理前后的兩種蛋白質(zhì)測IR光譜，光譜范圍為4000～550cm-1，光譜分辯率為4cm-1。

1.2.5 凍藏時間對面團(tuán)質(zhì)構(gòu)性能的影響 取面粉50g加入30mL蒸餾水制成直徑約3cm的面團(tuán)，制作25個上述面團(tuán)平均分為5組，除第一組不做任何處理外，其他四組先在-40℃下速凍40min，然后在-18℃下分別凍藏7、14、21、28d。凍藏處理后樣品在測定質(zhì)構(gòu)時需在30℃下解凍15min，然后采用物性測試儀(TPA模式)測定面團(tuán)的質(zhì)構(gòu)性能。

具體實(shí)驗條件如下：使用質(zhì)構(gòu)儀P50探頭，參數(shù)設(shè)定為：測前速度:3.00mm/s，測試速度:1.00mm/s，測后速度:5.00mm/s，樣品模式:距離:5mm，間隔時間:3s，探頭類型:自動，探頭力度:5.0g。

2 結(jié)果與討論

2.1麥醇溶蛋白和麥谷蛋白提取后的純度分析

圖1、圖2分別為麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的凝膠柱層析圖。由圖可知，提取出的麥醇溶蛋白只有一個峰，說明沒有其他物質(zhì)參雜。而麥谷蛋白的層析圖出現(xiàn)兩個峰則是由于麥谷蛋白有低相對分子質(zhì)量亞基和高相對分子質(zhì)量亞基所致。所以兩種提取蛋白純度較高，可以進(jìn)一步分析研究使用。

圖1 麥醇溶蛋白柱層析圖

圖2 麥谷蛋白柱層析圖

2.2凍藏時間對麥醇溶蛋白和麥谷蛋白巰基和二硫鍵的影響

巰基和二硫鍵對維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有重要作用。將速凍40min后的濕面筋蛋白放入-18℃下貯藏0～30d，凍藏時間分別為0、7、14、21、28d，再從中提出兩種蛋白質(zhì)分別測定巰基和二硫鍵的含量，以觀察凍藏時間對麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的巰基和二硫鍵的影響。

從圖3和圖4中可以看出，小麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的自由巰基含量都逐漸增加，二硫鍵含量都逐漸降低。造成這種結(jié)果的原因有兩方面，一是凍藏過程中冰晶隨凍藏時間不斷生長或重結(jié)晶，這種機(jī)械力使面筋蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致蛋白分子內(nèi)外部的二硫鍵部分?jǐn)嗔?、分子?nèi)部的巰基暴露，進(jìn)而使游離的巰基含量增加。另外則是由于自由水含量的減少，凍藏處理會引起濃縮效應(yīng)，使蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間二硫鍵交換反應(yīng)增多[11]。

圖3 凍藏時間對麥醇溶蛋白巰基和二硫鍵的影響

圖4 凍藏時間對麥谷蛋白巰基和二硫鍵的影響

總體來看，麥谷蛋白的巰基和二硫鍵變化程度均要大于醇溶蛋白的巰基和二硫鍵變化程度。這可能是由兩方面原因造成的：一是因為兩種蛋白的結(jié)構(gòu)不同，麥醇溶蛋白的二硫鍵均分布在分子內(nèi)部，與外部環(huán)境有一定隔離，而麥谷蛋白分子外部也有裸露的二硫鍵，這些二硫鍵容易受到影響而發(fā)生斷裂，故麥谷蛋白的變化程度要大于麥醇溶蛋白。二是由面筋蛋白的結(jié)構(gòu)決定的，在面筋形成過程中，醇溶蛋白與麥谷蛋白相互作用，醇溶蛋白進(jìn)入麥谷蛋白之中，麥谷蛋白起著拉動和包裹的作用，在面筋蛋白的外側(cè)，而醇溶蛋白則相對在內(nèi)側(cè)[12]。由于麥谷蛋白緊鄰?fù)獠凯h(huán)境，所以可能在速凍過程中受到環(huán)境的影響也比較大。

2.3凍藏處理后麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的紅外光譜分析

2.3.1 蛋白質(zhì)紅外酰胺Ⅲ帶各峰的指認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)[14]其中α-螺旋的峰位置在1330～1290cm-1，β-折疊的峰位置在1220～1250cm-1，β-轉(zhuǎn)角的峰位置在1265～1295cm-1。

2.3.2 凍藏處理麥醇蛋白、麥谷蛋白的二級結(jié)構(gòu)指認(rèn)、各結(jié)構(gòu)含量及分析 通過去卷積和二階導(dǎo)數(shù)處理的紅外光譜酰胺Ⅲ帶(1220～1330cm-1)的方法來研究凍藏時間對麥醇溶蛋白、麥谷蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響。

圖5為凍藏0、14、28d后麥醇溶蛋白的紅外光譜酰胺Ⅲ帶原始圖，經(jīng)去卷積、二階導(dǎo)數(shù)處理后，麥醇蛋白酰胺Ⅲ帶中的各子峰的結(jié)構(gòu)歸屬見表1；圖6為凍藏0、14、28d后麥谷蛋白的紅外光譜酰胺Ⅲ帶原始圖，經(jīng)去卷積、二階導(dǎo)數(shù)處理后，麥谷蛋白酰胺Ⅲ帶中的各子峰的結(jié)構(gòu)歸屬見表2。經(jīng)凍藏處理后的麥醇溶蛋白、麥谷蛋白根據(jù)其各子峰面積占總峰面積的比等于對應(yīng)結(jié)構(gòu)含量的原則，對麥醇溶蛋白樣品中各結(jié)構(gòu)的含量進(jìn)行計算(表1、表2)。

圖5 凍藏處理0～28d后麥醇溶蛋白的紅外光譜去卷積酰胺Ⅲ帶

圖6 凍藏處理0～28d后麥谷蛋白的紅外光譜去卷積酰胺Ⅲ帶

結(jié)構(gòu)單元峰位置(cm-1)峰面積比例(%)0d14d28dβ-折疊1220123751.453.856.8α-螺旋1310133022.520.619.6β-轉(zhuǎn)角127926.125.623.6

由表1可知，與未凍藏的麥醇溶蛋白相比，經(jīng)凍藏處理后，其二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角的含量也隨著凍藏時間的延長逐漸減少，而β-折疊的含量則隨著凍藏時間增加。

由表2可知，與未凍藏的麥谷蛋白相比，經(jīng)凍藏處理后，其二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的含量隨著凍藏時間的延長顯著減少，而β-折疊則隨著凍藏時間明顯增加。

表2 凍藏處理0～28d后麥谷蛋白的 二級結(jié)構(gòu)指認(rèn)及各結(jié)構(gòu)含量

由表1、表2可知，隨著凍藏時間的增加，兩種蛋白中的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的含量逐漸減少，β-折疊的含量持續(xù)增加。α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角減少是由于在凍藏過程中水合環(huán)境的改變，冰晶生長產(chǎn)生的機(jī)械力、自由水的減少使維持α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角的氫鍵斷裂、減少，螺旋和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)遭到了破壞，形成小分子物質(zhì)，在自由水減少的同時，小分子物質(zhì)在非共價鍵的作用下發(fā)生相互聚集，從而使β-折疊含量升高。

麥醇溶蛋白為球狀蛋白，麥谷蛋白多為大聚體。對比表1、表2可以看出麥谷蛋白中β-轉(zhuǎn)角的含量明顯少于麥醇溶蛋白，這是由于β-轉(zhuǎn)角通常出現(xiàn)在球狀蛋白表面的緣故。而麥谷蛋白α-螺旋和β-折疊的巨大變化是由于麥谷蛋白接觸水合環(huán)境的面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于麥醇溶蛋白，麥谷蛋白受水合環(huán)境的影響大，則對其α-螺旋結(jié)構(gòu)的破壞程度和蛋白質(zhì)聚集的加劇程度也比醇溶蛋白要大。

2.4凍藏時間對面團(tuán)質(zhì)構(gòu)性能的影響

食品的TPA測定是指在對人們進(jìn)食時咀嚼力的分析基礎(chǔ)上，對食品機(jī)械特性中的硬度、粘著性、彈性、恢復(fù)性、咀嚼性等給以定量的評價。模擬進(jìn)食時咀嚼動作對食品進(jìn)行處理，從而能得到其在受力過程中所表現(xiàn)出的特性變化規(guī)律，不同的食品一般具有差別很大的質(zhì)構(gòu)性能。表3是在分別凍藏處理0、7、14、28d后，面團(tuán)的TPA實(shí)驗測定結(jié)果。

表3 凍藏時間對面團(tuán)質(zhì)構(gòu)性能的影響

由表3可以看出，隨著凍藏時間的延長，面團(tuán)的各種質(zhì)構(gòu)性能均不同程度的下降，其中硬度、粘性和咀嚼性在0～7d內(nèi)變化比較大，而彈性、回復(fù)性則在14～28d內(nèi)變化比較大。

麥醇溶蛋白為單體蛋白，球形，與麥谷蛋白相比，表面積較小，分子間作用比較弱，其對面團(tuán)的粘性和延展性起決定作用[15]。由于冷凍過程使醇溶蛋白二硫鍵減少，醇溶蛋白分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)強(qiáng)度降低，則不可避免地造成面團(tuán)的延展性降低；而β-轉(zhuǎn)角對蛋白質(zhì)的粘性有重要影響[16]，凍藏后的麥醇溶蛋白紅外圖譜中β-轉(zhuǎn)角的減少則會導(dǎo)致面團(tuán)粘性降低。

麥谷蛋白聚集體的主要依靠二硫鍵維持大分子結(jié)構(gòu)，而麥谷蛋白聚集體又是面團(tuán)彈性和硬度的決定性因素，所以麥谷蛋白二硫鍵的減少導(dǎo)致麥谷蛋白大聚體的減少，這是面團(tuán)的彈性和硬度降低的主要原因。α-螺旋結(jié)構(gòu)性質(zhì)穩(wěn)定，堅韌又富有彈性，其含量的減少對面團(tuán)的彈性和硬度的降低也起著重要作用。麥谷蛋白大聚體的形成會促進(jìn)β-折疊的形成，但β-折疊結(jié)構(gòu)的增多并不能完全說明麥谷蛋白大聚體數(shù)量的增多[14]。麥谷蛋白又是決定烘焙品質(zhì)的主要因素，其與面團(tuán)的強(qiáng)度和烘焙后面包的持氣能力有非常重要的關(guān)系，冷凍對其結(jié)構(gòu)的影響也直接導(dǎo)致面團(tuán)強(qiáng)度下降，烘焙后產(chǎn)品的品質(zhì)降低[13]。

3 結(jié)論

隨著速凍時間的延長，兩種蛋白質(zhì)中的巰基含量增加，二硫鍵的含量減少。隨著凍藏時間的延長，兩種蛋白質(zhì)中的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量下降，而β-折疊結(jié)構(gòu)則升高。

從實(shí)驗中看出，麥谷蛋白巰基、二硫鍵、α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和β-折疊含量的變化程度均大于麥醇溶蛋白，這可能是由于面筋蛋白形成時麥谷蛋白對麥醇溶蛋白的包裹、拉伸以及麥谷蛋白、醇溶蛋白本身的結(jié)構(gòu)不同造成的結(jié)果。

通過質(zhì)構(gòu)性能的測定將面團(tuán)性質(zhì)的變化與兩種蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化聯(lián)系起來，實(shí)驗表明速凍和凍藏對于麥谷蛋白和麥醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)有較大的影響，而兩種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化使面團(tuán)的性質(zhì)也發(fā)生了很大的變化。我們可以通過保護(hù)兩種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)來提高面團(tuán)品質(zhì)。

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Effect of the time of frozen on secondary structure of glutenin and gliadin and textural properties of dough

LIXue-hong，HUZhong-yu,LUYong,JINGXiao-yan,LIUYan-qi

(Department of Food and Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China)

The changes of the contents of-SH and-SS and secondary structure in the wheat gliadin and glutenin at the condition of-18℃ for frozen storage 0～28days were investigated,and the relation of the changes of the contents of-SH and-SS and secondary structure in the wheat gliadin and glutenin were discussed. The results showed that the contents of-SS,β-folded increased,the content of-SH,α-helix,β-turn reduction decreased. These changes of glutenin were greater than gliadin. Texture results showed that:the viscosity,elasticity and hardness of frozen dough were influenced by the reduction of the contents of the SS,α-helix and β-turn structure in two proteins.

glutenin;gliadin;structure;frozen storage;texture

2013-06-13

李學(xué)紅(1969-)，女，博士，教授,研究方向：淀粉資源開發(fā)。

科技部十二五科技支撐計劃項目(2012BAD37B06-08)；2012年鄭州市科技攻關(guān)項目。

TS205.7

：A

：1002-0306(2014)01-0083-05