馮碩恒 謝奉軍 蔡佐楠 麥康森 艾慶輝

(中國海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，青島 266003)

磷脂是分子中含有磷酸的復(fù)合極性脂，在仔稚魚發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。首先，磷脂是細(xì)胞膜的重要組成成分［1］，對維持細(xì)胞膜功能的完善起著重要作用;其次，魚類利用極性脂的能力要高于中性脂，因此，磷脂在胚胎發(fā)育階段和仔稚魚早期階段發(fā)揮著重要的供能作用［2-4］;此外，磷脂分解代謝還能產(chǎn)生類二十烷酸、二脂酰甘油和肌醇磷酸等生物活性物質(zhì)，對維持魚類正常的生理活動具有重要意義［5］。目前，在水產(chǎn)動物上的研究表明，微顆粒飼料中添加磷脂可顯著提高仔稚魚的生長、存活、抗應(yīng)激能力、脂肪吸收和轉(zhuǎn)運以及飼料的適口性［6-13］。然而，在魚類上對磷脂代謝的研究卻較少。

目前，諸多學(xué)者認(rèn)為魚類磷脂分解代謝機制與哺乳動物是一致的，即在腸道內(nèi)由胰腺分泌的磷脂酶A2(PLA2)水解產(chǎn)生游離的脂肪酸和溶血磷脂，再被腸細(xì)胞吸收［14］。根據(jù)磷脂酶起作用的酯鍵不同，磷脂酶分為 A1、A2、C和 D型。由于PLA2能特異性水解磷脂sn-2位的脂肪酸，產(chǎn)生溶血磷脂和游離脂肪酸，溶血磷脂和游離的脂肪酸分別在高等動物膜磷脂更新［15］和炎性反應(yīng)［16］過程中發(fā)揮重要作用，因此對PLA2的研究在哺乳動物中已成為焦點。Zambonino等［17］的研究發(fā)現(xiàn)，在海水仔稚魚開口后幾天就能檢測到PLA2。早期在真鯛肝胰腺中的研究發(fā)現(xiàn)PLA2有2種亞型，且其分子質(zhì)量較低的屬于Ca2+依賴型酶［18］。此外，Saele等［19］在大西洋鮭上確定了 PLA2-ⅠB 的序列，并在基因和蛋白質(zhì)水平上闡述了其隨大西洋鮭生長發(fā)育的變化。隨后，F(xiàn)ujikawa等［20］在真鯛上也發(fā)現(xiàn)了PLA2的新亞型PLA2-ⅠB，并對其在消化器官中的組織分布做了詳細(xì)闡述。在魚類上，已克隆到斑馬魚(Danio rerio，GenBank登錄號:AAA53229.1)、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus，GenBank 登錄號:XP_003445168.2)、青鳉(Oryziaslatipes，GenBank登 錄 號:XP_004068057.1)和紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes，GenBank登錄號:XP_003978485.1)等胞質(zhì)型磷脂酶A2(cPLA2)的cDNA全長或部分序列。但是，cPLA2基因表達與仔稚魚生長發(fā)育之間的關(guān)系鮮有報道。

Mai等［21］從組織學(xué)的角度系統(tǒng)分析了大黃魚仔稚魚到幼魚早期階段消化系統(tǒng)的變化情況。近年來，Zhao 等［13］、Xie 等［22］和 Li等［23］的研究均發(fā)現(xiàn)消化酶活力的大小在一定程度上能反映大黃魚仔稚魚消化系統(tǒng)的完善與否。然而，在轉(zhuǎn)錄水平上cPLA2的基因表達與大黃魚仔稚魚消化系統(tǒng)發(fā)育之間的關(guān)系卻未見報道。

大黃魚是我國特有的養(yǎng)殖種類，因其具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值，在我國東南沿海地區(qū)大黃魚的人工養(yǎng)殖得到廣泛推廣［24-26］。因此，本試驗旨在克隆大黃魚磷脂分解代謝關(guān)鍵酶cPLA2基因的cDNA全長，并分析cPLA2基因表達量隨大黃魚仔稚魚生長發(fā)育的變化趨勢，同時探究大黃魚消化系統(tǒng)發(fā)育與cPLA2基因表達變化之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚與飼養(yǎng)管理

試驗在福建省寧德水產(chǎn)技術(shù)推廣站進行。試驗用魚為該推廣站2012年3月份人工繁育的大黃魚魚苗。試驗期間所用海水經(jīng)室外蓄水池沉淀，2級砂濾池濾過，進育苗池前再經(jīng)過濾袋過濾。試驗期間，水溫(23±1)℃，pH 8.0±0.2，鹽度(23±2)‰。每桶內(nèi)設(shè)1個氣石，桶內(nèi)海水每天的換水量為150%～300%。白天水表面的光強度為100 lx左右。每天用聚乙烯管將漂浮在水面的污物及時去除，用虹吸管將桶底的殘余飼料、糞便和死苗及時吸出。從3～8日齡投喂輪蟲(Brachionus plicatilis)，6～11日齡投喂鹵蟲無節(jié)幼體，10～16日齡投喂鮮活橈足類，之后到40日齡投喂冷藏橈足類，每天飽食投喂 5 次(06:00、08:30、12:00、14:30和 17:00)。

1.2 取樣

魚苗孵化出來后，從1日齡開始取樣，隨后在3、7、11、15日齡時直接從育苗池中取樣。每個時間點隨機取3組，每組50尾魚。15日齡時隨機挑選規(guī)格整齊、體質(zhì)健壯、活力好的初始體重為(4.08±0.11)mg魚苗9 000尾，隨機放養(yǎng)于3個藍(lán)色塑料桶(180 L)內(nèi)，每桶3 000尾。在19、25、30、35和40日齡分別從3個養(yǎng)殖桶內(nèi)隨機取50尾魚，樣品保存在-80℃，用來分析cPLA2基因的表達。40日齡時，隨機取6尾大黃魚仔稚魚的肝臟，取后馬上置于液氮中，并儲存于-80℃中，用于cPLA2基因的克隆。

1.3 總RNA提取、cDNA合成和cPLA2基因的克隆

采用Trizol Reagent提取大黃魚幼魚(體重在20 g左右)肝臟總RNA，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳、GoldView染色顯示28S、18S和5S以檢測RNA的完整性，并用分光光度計檢測總RNA的濃度及純度。采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄用PrimerScript RT Reagent Kit合成cDNA第1鏈。以GenBank中斑馬魚、大西洋鮭、尼羅羅非魚、青鳉、紅鰭東方鲀、人和鼠等物種的氨基酸序列為模板，利用CODHOP(http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html)設(shè)計簡并引物cPLA21F和cPLA21R(表1)。然后進行PCR擴增反應(yīng)，克隆大黃魚cPLA2基因的部分片段。cPLA25＇端和3＇端非編碼區(qū)的擴增采用Clonetech SMARTTMRACE cDNA擴增試劑盒，按照說明書進行操作，采用的特異性引物分別為cPLA22F和cPLA22R(表1)。將獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆到pEASY-T1載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞上，挑選陽性克隆送往上海博尚生物科技有限公司進行測序。

1.4 序列分析和進化樹構(gòu)建

應(yīng)用NCBI上的BLAST工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)將克隆的基因進行同源性比對分析，并推斷其開放閱讀框(ORF)和編碼的氨基酸序列。使用軟件TMHMM(http:www.cbs.dtu.dk/services)來預(yù)測基因的跨膜域。使用SMART(http://smart.emblheidelberg.de/)和PROSITE軟件(http://kr.expasy.org/prosite/)來預(yù)測氨基酸序列中的功能位點或氨基酸結(jié)構(gòu)域。使用ProtParam程序(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)來計算氨基酸序列的物理和化學(xué)參數(shù)。根據(jù)選擇的相關(guān)基因序列使用CLUSTAL X1.83［27］和 MEGA 4.0［28］軟 件 來 構(gòu) 建 物 種 間cPLA2基因的物種系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。使用鄰位相連(neighbor-joining)法構(gòu)建進化樹［29］。

表1 本試驗中用到的引物序列Table 1 Sequences of primers used in this experiment

1.5 cPLA2基因的定量表達

采用實時定量PCR法來檢測cPLA2基因的表達量隨大黃魚仔稚魚生長發(fā)育的變化。實時定量PCR引物為PLA23F和PLA23R(表1)。

實時定量PCR體系為25 μL，其中上、下游引物(10 μmol/L)各 1 μL，第 1 鏈 cDNA 1 μL，2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (TaKaRa，日 本)12.5 μL和9.5 μL的無菌水。定量儀器為實時定量 PCR 儀 (Mastercyclereprealplex，Eppendorf，德國)。實時定量的程序為95℃持續(xù)2 min，1個循環(huán);95℃持續(xù)10 s，58.7℃持續(xù)10 s，72℃持續(xù)20 s，共計40個循環(huán)。之后，進行熔解曲線以檢驗每個PCR反應(yīng)只有1個PCR產(chǎn)物。通過4倍梯度稀釋得到5個不同濃度的cDNA模板，以每個濃度cDNA為模板，通過實時定量PCR得出每對引物每個濃度cDNA的循環(huán)數(shù)(Ct)值，以Ct值為縱坐標(biāo)，模板拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，擬合得到一條隨拷貝數(shù)變化的Ct值的直線，根據(jù)擬合得到的直線斜率和擴增效率的計算公式E=10(-1/Slope)-1(式中:E為擴增效率;Slope為斜率)，得出每對引物的擴增效率。在本試驗中，目的基因cPLA2的擴增效率為0.909 8，內(nèi)參基因β-actin的擴增效率為 0.978 3。由于 ΔCt(ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)的絕對值為0.041，約等于0，表明目的基因和內(nèi)參基因擴增效率基本一致，采用2-ΔΔCt方法測定目的基因的表達量［30］。

1.6 統(tǒng)計分析

結(jié)果采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，在單因素方差分析(one-way ANOVA)達到顯著水平(P＜0.05)時，采用Tukey’s檢驗進行多重比較，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因序列特征分析

通過序列分析可知，cPLA2基因cDNA全長共計2 550 bp，其中5＇端非編碼區(qū)176 bp，開放閱讀框 2 169 bp，3＇端非編碼區(qū) 205 bp，共編碼 723 個氨基酸，預(yù)測所編碼的蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為81.98 ku，理論等電點為5.21，將該序列提交至GenBank，獲得登錄號為 KF006240.1。軟件分析預(yù)測該蛋白質(zhì)可能含有42個磷酸化位點，包括24個絲氨酸位點、9個蘇氨酸位點和9個酪氨酸位點(圖 1)。

2.2 序列比對和進化樹分析

推導(dǎo)的大黃魚cPLA2基因的氨基酸序列與斑馬魚、紅鰭東方鲀、尼羅羅非魚和青鳉的cPLA2基因的氨基酸序列分別有75.80%、89.35%、87.96%和86.31%的相似性(圖2)。系統(tǒng)進化樹也顯示克隆到的大黃魚cPLA2基因與上述這幾種魚類的親緣關(guān)系較近，與其他物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。

圖1 大黃魚cPLA2基因的cDNA全長核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 cDNA full long nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of cPLA2gene of large yellow croaker

圖2 大黃魚與其他9種生物cPLA2基因氨基酸序列比對結(jié)果*Fig.2 Alignment results of cPLA2gene amino acid sequence between large yellow croaker and other 9 species

* 因像素較低，排版后圖片顯示不清，如有需要，可與作者聯(lián)系索取。

圖3 大黃魚與其他物種cPLA2基因氨基酸序列系統(tǒng)進化樹聚類分析Fig.3 Cluster analysis of phylogenetic tree of cPLA2gene amino acid sequence between large yellow croaker and other species

2.3 cPLA2基因表達量隨大黃魚仔稚魚生長發(fā)育的變化

由圖4可知，孵化后，大黃魚仔稚魚cPLA2基因的表達量隨日齡的增加先顯著升高(1、3、7日齡vs.15日齡，P＜0.05)，在15日齡時達到最高值，隨后顯著下降(15日齡vs.19日齡，P＜0.05)，之后趨于平穩(wěn)。

圖4 大黃魚仔稚魚cPLA2基因表達量隨日齡增加的變化Fig.4 Change of expression level of cPLA2gene with days of age increasing of large yellow croaker larvae

3 討論

采用同源克隆和cDNA末端快速擴增(RACE)技術(shù)克隆到大黃魚cPLA2基因的cDNA全長。首先通過分子質(zhì)量大小確定本試驗中克隆到的PLA2屬于胞質(zhì)型的，多序列比對分析發(fā)現(xiàn)克隆到的基因與cPLA2基因相似度較高。序列比對發(fā)現(xiàn)大黃魚cPLA2基因與其他魚類親緣關(guān)系較近，與哺乳動物親緣較遠(yuǎn)，符合進化規(guī)律。在鼠上的研究發(fā)現(xiàn)，cPLA2基因包括脂質(zhì)結(jié)合的Ca2+依賴的C2結(jié)構(gòu)域和起催化作用的α/β水解酶結(jié)構(gòu)域［31］。這 2 個結(jié)構(gòu)域影響 cPLA2的催化活性［32］。C2結(jié)構(gòu)域與內(nèi)膜結(jié)合是由神經(jīng)酰胺-1-磷酸的作用決定的，C2結(jié)構(gòu)域包含一段精氨酸、精氨酸和組氨酸高度保守序列(RxRH)，而RxRH可以調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺-1磷酸的特異性［33］。通過多序列比對發(fā)現(xiàn)，只有斑馬魚的cPLA2基因存在RxRH，而其他幾種魚類的保守序列是精氨酸、蘇氨酸、賴氨酸和組氨酸(RTKH)。這說明大黃魚cPLA2與膜結(jié)合的調(diào)節(jié)機制可能與哺乳動物的不太一致，需要進一步的研究。此外，脂肪酶的保守序列甘氨酸、絲氨酸、甘氨酸和絲氨酸(GxSGS)存在大黃魚的cPLA2基因中，且與其他物種高度保守。GxSGS還是區(qū)別cPLA2與其他類型PLA2的標(biāo)志［34］。

磷脂是魚類胚胎發(fā)育和早期發(fā)育階段重要的供能物質(zhì)［5］。3日齡以前大黃魚仔魚生長主要依靠卵黃囊營養(yǎng)，在這個階段磷脂被磷脂酶水解，進而發(fā)揮其供能作用，因此在剛孵化出(1日齡)的大黃魚仔魚可中檢測到cPLA2基因的表達。Zambonino等［17］發(fā)現(xiàn)海鱸仔稚魚開口覓食后幾天就能檢測到PLA2，這與本試驗的結(jié)果一致。盡管從3日齡起大黃魚已經(jīng)開口攝食，開始接受外源性營養(yǎng)(輪蟲)，但是在7日齡之前卵黃囊內(nèi)營養(yǎng)成分并未完全消耗掉［21］。從 3～7日齡，PLA2基因的表達量開始升高，但是并沒有出現(xiàn)顯著性差異，這可能因為生物餌料體內(nèi)磷脂酶存在的緣故。隨著生長發(fā)育的繼續(xù)，7日齡時大黃魚稚魚的食道延長，分為明顯的黏液分泌部位和起運輸功能的部位［21］，消化機能逐漸增強，開始投喂不同種類的生物餌料。15日齡(投喂鮮活橈足類)時cPLA2基因的表達量到最大值，這可能是大黃魚保持機體磷脂動態(tài)平衡的一種機制。19日齡時，cPLA2基因的表達量出現(xiàn)顯著下降，之后變得平穩(wěn)。21日齡時大黃魚稚魚形成胃腺［21］，胃腺的形成減輕了胰腺的負(fù)擔(dān)，進而使cPLA2基因的表達量下降，cPLA2的分泌也下降。

4 結(jié) 論

大黃魚從仔稚魚到幼魚早期的變形過程中，磷脂分解代謝的關(guān)鍵酶cPLA2基因的表達量呈現(xiàn)有規(guī)律的變化，這可能對機體保持體內(nèi)磷脂的動態(tài)平衡、維護細(xì)胞膜的流動性具有重要的意義。大黃魚仔稚魚cPLA2基因表達量的變化趨勢在一定程度上可以衡量大黃魚消化系統(tǒng)的發(fā)育情況。

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