何莉莉，楊慧敏,2，鐘哲科,2,*，公丕濤，劉玉學，呂豪豪，楊生茂

(1. 國家林業(yè)局竹子研究開發(fā)中心，杭州 310012； 2. 浙江省生物炭工程技術(shù)研究中心，杭州 310021; 3. 浙江省農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境資源與土壤肥料研究所，杭州 310021)

土壤細菌約占土壤微生物總量的70%—90%，主要包括各種細菌生理菌群如固氮菌、甲烷產(chǎn)生菌/氧化菌等，對土壤碳氮元素循環(huán)起著重要作用[17]。傳統(tǒng)研究細菌的方法主要是室內(nèi)平板培養(yǎng)法，但大多數(shù)細菌不可培養(yǎng)致使其存在一定的局限性[18]?，F(xiàn)代分子生物學技術(shù)通過直接或間接方法提取土壤DNA，從基因水平研究土壤微生物的多樣性[19-20]。本文通過對比常規(guī)施肥，秸稈、生物炭與化肥混施等不同施肥處理，研究生物炭對水稻田土壤細菌群落多樣性的影響。運用分子生物學技術(shù)PCR-DGGE從遺傳多樣性方面對土壤細菌群落多樣性進行表征，旨在揭示生物炭對農(nóng)田土壤微生物多樣性的影響，為生物炭對土壤質(zhì)量演變及其生產(chǎn)性能提高等提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地點位于浙江省海寧市許村鎮(zhèn)楊渡村(120°24′23″ E，30°26′07″ N)，隸屬浙江省農(nóng)業(yè)科學院楊渡試驗基地。屬亞熱帶海洋性季風氣候，海拔3—4 m，年降雨量1500—1600 mm，蒸發(fā)量1000—1100 mm，年平均氣溫16—17℃，無霜期240—250 d，年日照時數(shù)1900— 2000 h，年太陽輻射量100—115 J/cm2。土壤類型歸屬水稻土類、黃松田土種。

1.2 試驗處理

本試驗設置6個不同的施肥處理，分別是空白對照(CK1)、常規(guī)施肥(CK2)、秸稈還田+常規(guī)施肥(T1)、稻桿炭+常規(guī)施肥(T2)、稻桿炭+70%常規(guī)施肥(T3)及垃圾炭+常規(guī)施肥(T4)。種植制度為水稻-油菜輪作，其中，油菜施氮量為150 kg/hm2，化肥施用均按照N∶P2O5∶K2O=2∶1∶1.2實施，氮肥為尿素，磷肥為普通過磷酸鈣，鉀肥為氯化鉀。減量施肥為常規(guī)施肥量的70%。隨機區(qū)組設計，每個處理設置3個重復，小區(qū)面積94 m2。

試驗始于2011年7月，化肥與秸稈、生物炭一次性施入，生物炭粒徑大小為1—2 mm。供試土樣于2012年5月29日第1輪油菜收割后采集，取0—20 cm表層土壤，用四分法混勻樣品，取1 kg左右?guī)Щ貙嶒炇?。去雜過2 mm篩，充分混勻后一份風干供土壤pH、全氮、總有機碳、有效磷和速效鉀等測定，另一份鮮樣用于土壤DNA提取，-75℃冷凍儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 供試材料

試驗所用的秸稈炭及垃圾炭分別由水稻秸稈、生活垃圾于600℃炭化所得。秸稈炭、垃圾炭的含碳量分別為42.7%、30.3%，比表面積分別為81.8 m2/g、12.9 m2/g。各個區(qū)組施肥處理及土壤理化性質(zhì)如表1所示。

表1 不同施肥處理土壤理化性質(zhì)

表中同列不同小寫字母表示5%水平的差異性顯著; 空白對照 (CK1)；常規(guī)施肥(CK2)；秸稈還田+常規(guī)施肥 (T1)；稻桿炭+常規(guī)施肥 (T2)；稻桿炭+70%常規(guī)施肥(T3)；垃圾炭+常規(guī)施肥(T4)；常規(guī)施肥(RF)；稻桿 (RS)；稻桿炭 (RSC)

Figure with the same small letter is not significant difference at 5% level; Control blank (CK1), Regular fertilizing (CK2)/RF, Straw returning + regular fertilizing (T1), Rice stem carbon+ regular fertilizing (T2), Rice stem carbon+70% regular fertilizing (T3), Garbage carbon+ regular fertilizing (T4), Rice stem(RS), Rice stem carbon(RSC)

1.4 土壤DNA提取及聚合酶鏈式反應(PCR)

采用上海生工生物工程公司提供的試劑盒(Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒)提取土壤總DNA。PCR引物為細菌通用引物338FC-GC(引物1：5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGG-GCGGGGCGGGG GCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和518R(引物2：5′-ATTA-CCGCGGCTGCTGG-3′)，均由上海生工生物工程公司提供。

50 μL PCR反應體系： Premix Taq酶25μL；引物1/1 μL、引物2/1 μL；模板1 μL，最后加滅菌水至50 μL。PCR反應條件：94℃預變性2 min；35個循環(huán)為94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s；最后補充72℃延伸7min；擴增后的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

(1)聚丙烯酰胺凝膠濃度是8%，變性梯度從上到下是35%—55%，上樣量為45 μL。運行條件為：1×TAE電泳緩沖液，60℃電泳條件下，85 V，16 h。電泳完畢后，用SYBR GREEN避光染色30 min，再用去離子水漂洗。染色后的凝膠用Bio-RAD的GeDoc-2000凝膠成像系統(tǒng)拍照；用Quantity One分析軟件分析樣品電泳條帶的數(shù)量、亮度峰值及平均光密度值。各泳道圖譜的相似性通過計算戴斯系數(shù)比較得出，通過非加權(quán)配對算數(shù)平均法UPGMA對各泳道進行聚類分析。戴斯系數(shù)：

Cs=2j/(a+b)

式中,j是a、b共有的條帶數(shù)，a、b是各自的條帶數(shù)，c的范圍是從0(沒有共同條帶)到1(所有條帶都相同)。

(2)微生物遺傳多樣性指數(shù)計算方法：

Shannon-Weaver Index指數(shù)：

均勻度指數(shù)：E=H/lns

式中,Pi=ni/N，ni為DGGE圖譜中第i條帶的峰密度，N為全部條帶峰密度的總和，s為個體所有的條帶數(shù)，H為Shannon-Weaver Index指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DGGE分析16S rDNA V3區(qū)片段的PCR產(chǎn)物

細菌PCR產(chǎn)物的DGGE譜圖(圖1a)可直觀的反映各處理對應的條帶數(shù)目及遷移距離等信息，從中得出不同處理均可分離得到20條以上的電泳條帶，且多數(shù)條帶為不同處理間所共有的，但不同處理之間PCR產(chǎn)物的條帶數(shù)及亮度存在一定的差異。運用Quantity One軟件對圖譜進行基本的背景排除，然后經(jīng)泳道識別、條帶識別和配對等步驟，可得到泳道間的對比分析結(jié)果圖1b(Quantity One軟件能識別肉眼無法分清和區(qū)分的條帶，實圖1a與電泳比較圖1b編號不一致)。未施肥處理CK1與其他施肥處理相比較，其條帶數(shù)較少且亮度較淺，未施肥處理CK1的1—3號泳道條帶位置及亮度幾乎無差異，重復性較好；各施肥處理之間共有條帶數(shù)較多但亮度差異明顯，且各處理的3個樣品條帶位置幾乎一致，只是個別條帶亮度一致性較差。如泳道4的編號1條帶與泳道5、6的1號條帶亮度差異較大，但泳道5號和6號的優(yōu)勢菌群相似性較高。

圖1 16S rDNA V3區(qū)擴增片段DGGE分析結(jié)果(a)及電泳比較圖(b)

仔細觀察圖1a可以發(fā)現(xiàn)，條帶編號3、4、5、6所代表的菌群是各處理所共有的優(yōu)勢菌群。與未施肥處理相比，施肥處理不同程度的增加了優(yōu)勢菌群代表的條帶亮度，如T3處理的4號條帶亮度比其他處理亮度明顯增加。秸稈還田(T1)處理中編號為1的條帶亮度較生物炭處理(T2—T4)處理中編號為1的條帶亮度亮，可能是由于秸稈富含易分解利用的碳源，從而促進了該菌群的活動。生物炭處理明顯增加了各條帶的亮度，且出現(xiàn)了特征菌群，如條帶編號7。條帶編號2是T3處理的特征菌群，說明施加生物炭與常規(guī)施肥相比，改變了土壤細菌群落的結(jié)構(gòu)，提高了細菌群落的多樣性。常規(guī)施肥與不施肥相比改變了細菌群落的豐度，但對其群落結(jié)構(gòu)影響不大。

2.2 不同施肥處理的土壤細菌群落多樣性分析

運用Quantity One軟件對DGGE圖譜做相似性分析，得到不同處理微生物群落相似性指數(shù)(表2)。分析各處理間的相似性矩陣可以發(fā)現(xiàn)，不同處理之間的相似性都高于48.6%。其中，常規(guī)施肥CK2與空白對照CK1的相似性為61.6%；秸稈還田、稻桿炭、垃圾炭處理的施肥方式(T1—T4)與空白對照CK1的相似性分別為59.2%、56.2%、48.6%、58.1%，與常規(guī)施肥的相似性分別為67.7%、62.2%、57.7%、62.7%。王奇贊等[21]認為，不同處理之間相似性高于60%，說明處理之間有很好的相似性。本研究中秸稈還田、稻桿炭、垃圾炭處理與空白對照CK1、稻桿炭減量T3處理與常規(guī)施肥的相似性質(zhì)都低于60%，這表明施入外源物質(zhì)可能改變了土壤細菌群落結(jié)構(gòu)，而單施化肥對土壤細菌群落影響不大。利用相似性矩陣，通過UPGMA (The Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Averages)進行聚類分析(圖2)進一步發(fā)現(xiàn)：所有處理土壤的微生物群落可分成4類，空白對照單獨分為1類，且明顯區(qū)別于其他處理；施肥處理中，施加稻桿炭的兩個處理距離較近聚為1類，垃圾炭與秸稈還田處理聚為1類。原因可能是不同施肥處理改變了土壤微生物的生存環(huán)境并影響了相互之間的適應性。

表2 不同處理微生物群落相似性指數(shù)

圖2 不同處理DGGE譜圖的聚類分析

Shannon-Weaver指數(shù)為一個可以直觀的反映細菌群落遺傳多樣性的指標，主要包括兩個成分：細菌種數(shù)和細菌種間的均勻度(E)；細菌群落DNA的豐富度(S)可以用細菌種數(shù)即電泳條帶的數(shù)量表征。不同處理間細菌群落的豐富度與Shannon-Weaver Index指數(shù)見圖3。由圖可知，空白對照CK1的微生物豐度及Shannon-Weaver Index指數(shù)最低，這與劉恩科等[22]的研究結(jié)果類似，長期不施肥而種植作物的土壤可見條帶數(shù)比化肥與廄肥配施的土壤條帶數(shù)少32%。秸桿還田、稻桿炭、垃圾炭施肥處理的土壤微生物豐富度高于常規(guī)施肥CK2與空白對照處理CK1，約是空白對照處理下的兩倍；秸桿還田施肥處理的土壤微生物豐富度低于生物炭處理；生物炭施肥處理中，稻桿炭處理的土壤微生物Shannon-Weaver Index指數(shù)略高于垃圾炭處理，這可能由于本試驗所用的稻桿炭比表面積比垃圾炭比表面積高約5倍，生物炭大的比表面積及多孔性可為土壤微生物提供適宜的生存環(huán)境。統(tǒng)計分析表明微生物多樣性指數(shù)與豐富度極相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.939(P=0.000<0.01)，不同處理的均勻度指數(shù)分別為1.37、1.35、1.36、1.33、1.35、1.38(P>0.05)，差異性不顯著。

圖3 不同處理細菌群落的豐富度與Shannon-Weaver Index指數(shù)

2.3 土壤細菌群落與環(huán)境因子的相關(guān)性分析

用DGGE譜圖所得到的細菌群落的條帶信息與土壤理化性質(zhì)進行相關(guān)性分析，如表3。細菌群落的結(jié)構(gòu)變化與各理化性質(zhì)的相關(guān)性順序依次為速效鉀>總有機碳>有效磷>全氮>pH。細菌群落的結(jié)構(gòu)變化與土壤速效鉀養(yǎng)分含量相關(guān)性最大，與總有機碳含量相關(guān)性其次?？赡茉蛴信c南方酸性土壤有關(guān)，其地處濕熱地帶、高溫多雨、土壤的分解與礦化過程較快，土壤元素的遷移及淋溶較強，尤其是鉀的流失量較大，土壤含鉀量低，而植物秸稈等富含鉀元素，回歸到土壤改善了土壤質(zhì)量，促進土壤微生物的生長；礦質(zhì)元素是構(gòu)成微生物細胞結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)細胞滲透壓等微生物生命活動不可缺少的物質(zhì)。秸稈還田將收割所帶走的有機物質(zhì)及營養(yǎng)元素返還土壤，增加土壤總有機碳，減少土壤侵蝕，提高了土壤質(zhì)量，為微生物的生長提高適宜的環(huán)境。生物炭比表面積大，豐富的孔隙及適宜的pH為微生物的生長提供適宜的生長環(huán)境。從表看出，土壤酸堿度與微生物群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性較小，這可能是由于各處理的土壤pH值處于5.8—6.6之間，差異性很小且處于微生物生長所需的酸堿度范圍內(nèi)，對其結(jié)構(gòu)影響不大。

表3 土壤細菌群落與土壤養(yǎng)分之間的相關(guān)性指數(shù)

3 結(jié)論與討論

PCR-DGGE技術(shù)利用變性梯度分離細菌群落16S rDNA V3片段PCR產(chǎn)物，從而得出數(shù)目不等、位置各異的電泳條帶。本研究中，6種不同的處理均可分離得到20條以上的電泳條帶，說明水稻田土壤細菌群落較為豐富。大部分條帶為共有條帶，表明了這一部分條帶所代表的土壤細菌種類和數(shù)量較穩(wěn)定，基本上不受施肥管理措施的影響，但也有一部分條帶受施肥處理的影響增加或缺失，生物炭處理明顯增加了各條帶的亮度，且出現(xiàn)了特征菌群。

由戴斯系數(shù)計算出的6個處理間的相似性系數(shù)發(fā)現(xiàn)，秸稈還田、生物炭施肥處理與空白對照CK1、稻桿炭減量T3處理和常規(guī)施肥的相似性均較低。土壤養(yǎng)分含量和碳源供給是影響微生物群落的主要因素[23]，秸桿還田帶入大量的無機營養(yǎng)元素和有機物，短期內(nèi)會促進分解纖維素的微生物群落的生長；生物炭含有的一些低分子易分解有機化合物可以作為微生物的碳源，有利于提高微生物的生物量和活性，且其吸附能力強、孔隙率高，適合作為微生物和養(yǎng)分的載體。本試驗施肥處理配施的秸桿和生物炭改變了土壤微生物生存的根際微域環(huán)境，從而影響了微生物的組成及其活性。

對DGGE譜圖信息進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)：生物炭處理的施肥方式的細菌豐富度指數(shù)及Shannon-Weaver Index指數(shù)最高，約是未施肥處理的2倍；土壤細菌群落結(jié)構(gòu)變化與土壤速效養(yǎng)分、總有機碳含量有較大的相關(guān)性。研究表明，將生物炭施加到土壤對土壤的物理[24]、化學及生物特性[25]能產(chǎn)生積極的影響，從而改善了土壤質(zhì)量為微生物提供了適宜的生存環(huán)境。生物炭在土壤中穩(wěn)定性高、分解速度慢，從長期效應來說，生物炭配施化肥更有利于提高土壤微生物群落多樣性[26-27]。

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