張 靚，杜 偉

（大理學(xué)院附屬醫(yī)院，云南大理 671000）

原發(fā)性肝癌（Hepatic carcinoma）是我國高發(fā)的惡性腫瘤之一，臨床發(fā)現(xiàn)肝癌的發(fā)病例呈逐年上升趨勢。針對該腫瘤的治療方法有：生物靶向治療、開腹手術(shù)以及放化療等。介入手術(shù)是目前在疾病診斷與治療中的一種微創(chuàng)治療方法〔1〕，肝癌的介入治療是通過導(dǎo)管向腫瘤組織靶血管進(jìn)行化療栓塞，針對小肝癌（＜3 cm）療效良好，也適用于巨型肝癌，經(jīng)過多次栓塞化療后瘤體積縮小，作為后期手術(shù)切除的輔助性治療。但目前臨床發(fā)現(xiàn)部分患者在介入治療后出現(xiàn)肝功能異常，甚至肝衰竭死亡〔2-3〕。

在多種腫瘤如胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌等腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)NF-кB的高表達(dá)〔4〕。表明NF-кB活化在腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移起到關(guān)鍵的作用。同時NF-кB作為人體細(xì)胞內(nèi)的一類重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，現(xiàn)研究已表明NF-кB與免疫反應(yīng)、炎癥和急性反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡、病毒感染等多種病理過程有一定的相關(guān)性〔5-6〕。1986年Sen等最早發(fā)現(xiàn)NF-кB（nuclear factor-кB）〔2〕一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，廣泛存在于真核細(xì)胞中。本研究建立動物肝癌模型行TACE治療，研究NF-кB在腫瘤及癌旁組織中的表達(dá)。

1 材料

1.1 實驗動物 成功建立肝癌模型59例，見圖1。A組共29例，B組30例，種植后3周時行CT掃描（平掃+增強(qiáng)）以及肝動脈化療栓塞（TACE）治療術(shù)，經(jīng)CT、MRI及數(shù)字減影血管造影（DSA）檢查后，證實種植成功30例，見圖2～4。C組（對照組）為20例，CT定位肝穿刺后注射生理鹽水。

圖1 兔VX2肝癌模型大體，可見病灶呈白色魚肉樣改變，病灶局限，為典型的兔原發(fā)性肝癌模型

圖2 兔VX2肝癌模型CT平掃及增強(qiáng)掃描，可見腫瘤組織呈低密度，中心密度更低，邊緣強(qiáng)化

圖3 兔VX2肝癌模型MRI平掃及增強(qiáng)掃描，T1WI為低信號，T2WI為高信號，中央可見低信號壞死區(qū)

圖4 兔VX2肝癌模型DSA顯示腫瘤供血動脈增多，腫瘤組織染色

1.2 主要試劑 NF-кB鼠抗兔多克隆抗體（購于武漢博士德）、二抗（抗鼠/兔）試劑及DAB顯色試劑（購于Dako公司）等。

2 方法

2.1 實驗動物分組 A組（肝癌組）29只，B組（介入治療組）30只，B組于腫瘤種植后3周左右行CT確定腫瘤位置，后行TACE術(shù)治療，TACE治療后約10小時取材，對照組取材時間一致。

2.2 取材及石蠟包埋及HE染色 組織經(jīng)過固定后進(jìn)行石蠟包埋，切片（厚度為4 um），行蘇木精—伊紅染色（HE）。

2.3 免疫組織化學(xué)染色 采用Envision TM二步免疫組化法，具體步驟參見博士德免疫組化說明書。

2.4 判斷標(biāo)準(zhǔn) NF-кB主要在細(xì)胞漿內(nèi)陽性表達(dá)〔7〕，顏色分別呈黃色、棕黃色、棕褐色。每張切片選取10個視野（400倍鏡下），按陽性細(xì)胞數(shù)和顏色深度來判定：①陽性細(xì)胞：0分（＜5%），1分（5%～24%），2分（25%～50%），3分（51%～75%），4分（＞75%）；②顏色深度：0分（無著色），1分（淡黃色），2分（黃棕色），3分（棕褐色）。

再通過陽性細(xì)胞數(shù)以及染色深度評分相加之和判定結(jié)果：＜2分陰性（-），2～3分弱陽（+），4～5分陽性（++），6～7分強(qiáng)陽性（+++）。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行分析，采用未矯正χ2檢驗，P＜0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 HE染色 腫瘤細(xì)胞梁索狀分布，細(xì)胞核增大明顯，核深染。腫瘤部分區(qū)域可見壞死，大量炎性細(xì)胞以及菌團(tuán)，A組癌旁肝細(xì)胞有輕度脂肪變性以及可見少量凋亡細(xì)胞。B組癌旁組織內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤，以中性粒、單核細(xì)胞為主，同時也可見肝細(xì)胞脂肪變，以及凋亡細(xì)胞。

3.2 NF-кB的免疫組織化學(xué)檢測 免疫組化分腫瘤組癌組織為A1，癌旁組織為A2，介入治療組腫瘤組織為B1，癌旁組織為B2，對照組為C。

A1組29例腫瘤組織內(nèi)，NF-кB陽性表達(dá)者21例，陽性率為72.4%，相應(yīng)的A2組陽性表達(dá)為11例，陽性率為37.9%；B1組陽性表達(dá)共24例，陽性率為82.4%，B2組陽性表達(dá)18例，陽性率60%。C組僅2例為陽性表達(dá)，陽性率為10%，各組與對照比較，除A2外差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），A2與C組比較P ＞0.05，A1、B1、A2、B2兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5～14。

圖5 正常肝組織HE染色（×100）

圖6 正常肝細(xì)胞組HE染色（×400）

圖7 VX2腫瘤組織HE染色（×40）

圖8 VX2腫瘤HE染色（×400）

圖9 NF-кB在VX2肝癌組織中的表達(dá)（×100）

圖10 NF-кB在VX2肝癌組織中的表達(dá)（×400）

圖11 NF-кB在VX2肝癌組織中的表達(dá)（強(qiáng)陽性）（×400）

圖12 TACE治療VX2肝癌后，NF-кB在肝癌組織中的表達(dá)（×400）

圖13 NF-кB在瘤旁肝組織中的表達(dá)（×400）

圖14 TACE治療VX2肝癌后，NF-кB在瘤旁肝組織中的表達(dá)（×400）

A1組29例腫瘤組織內(nèi)，NF-кB表達(dá)。見表1～2。

表1 NF-кB分別在肝癌組織、癌旁組織與正常肝組織的表達(dá)情況比較

表1所示，A2及C組比較，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而A1，B1，B2三組與C組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 肝癌組織以及癌旁組織內(nèi)NF-кB表達(dá)

經(jīng)過TACE治療后，腫瘤組織和癌旁肝組織內(nèi)的NF-кB表達(dá)均增高，TACE術(shù)前后腫瘤組織中NF-кB表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），而癌旁肝組織NF-кB表達(dá)明顯增高。

4 討論

本次研究中免疫組化檢測結(jié)果顯示HCC癌組織NF-кB表達(dá)明顯升高，表明NF-кB與肝癌有一定的相關(guān)性。C組與A1組組間統(tǒng)計不具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明原發(fā)性肝癌癌旁組織有一定代償。實驗研究證明造影劑和化療藥物如阿霉素、長春新堿、順鉑等均可以誘導(dǎo)NF-кB活化〔7-8〕。

本實驗免疫組化結(jié)果顯示癌組織中NF-кB表達(dá)高于癌旁組織，表明NF-кB與肝癌的發(fā)生以及發(fā)展有一定相關(guān)性，TACE治療后，癌旁肝組織NF-кB表達(dá)升高更為明顯，可能機(jī)制為：介入手術(shù)栓塞以及化療后導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)，激活NF-кB〔9-10〕。

TACE術(shù)后癌旁組織陽性率為60.0%，未行介入治療的癌旁組織陽性率為37.9%。TACE術(shù)后腫瘤旁肝組織內(nèi)NF-кB活性增高明顯，造影劑以及化療藥物對肝細(xì)胞造成損傷，栓塞導(dǎo)致癌旁組織缺血，產(chǎn)生炎性反應(yīng)，導(dǎo)致 NF-кB 表達(dá)增高〔11-14〕。TACE治療前后肝癌組織NF-кB的表達(dá)未見明顯差異，其機(jī)制可能是TACE術(shù)后腫瘤細(xì)胞被抑制〔15〕，細(xì)胞活性被抑制導(dǎo)致NF-кB抑制蛋白IКB的表達(dá)增加，IКB與NF-кB的親和力明顯大于其與DNA的親和力，與NF-кB結(jié)合后，抑制NF-кB的蛋白表達(dá)，抵消部分導(dǎo)致的NF-кB的活性表達(dá)增高的因素〔16〕。

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