劉偉，徐鑫，劉媛媛，劉斌，王喜梅

（1.河北省人民醫(yī)院 腫瘤科，河北 石家莊 050000；2.河北中醫(yī)學院 護理學院，河北 石家莊 050000；3.河北省人民醫(yī)院 急診科，河北 石家莊 050000；4.河北醫(yī)科大學研究生學院，河北 石家莊 050000）

喜泊分聯(lián)合放療對小鼠H22肝癌移植瘤的抑瘤增敏作用研究

劉偉1，2，徐鑫3，劉媛媛4，劉斌1Δ，王喜梅2

（1.河北省人民醫(yī)院 腫瘤科，河北 石家莊 050000；2.河北中醫(yī)學院 護理學院，河北 石家莊 050000；3.河北省人民醫(yī)院 急診科，河北 石家莊 050000；4.河北醫(yī)科大學研究生學院，河北 石家莊 050000）

目的觀察光敏劑喜泊分對小鼠H22肝癌移植瘤的抑瘤增敏效果。方法建立H22肝癌細胞小鼠移植瘤模型，將荷瘤小鼠隨機分為對照組、單純放療組、小劑量喜泊分加放療組（聯(lián)合Ⅰ組）、中劑量喜泊分加放療組（聯(lián)合Ⅱ組）、大劑量喜泊分加放療組（聯(lián)合Ⅲ組）共5組，觀察第比較5組小鼠14天瘤體積、抑瘤率、增敏q值、小鼠生存時間、病理、細胞凋亡等指標。結(jié)果喜泊分聯(lián)合放療能夠抑制小鼠移植瘤生長；各聯(lián)合治療組q值均＞1，均有放療增敏效果，以聯(lián)合治療Ⅲ組均值最大；聯(lián)合組較其他組細胞凋亡率升高，但組間比較差異無統(tǒng)計學意義；聯(lián)合治療組較對照組小鼠生存時間延長，以聯(lián)合Ⅱ組最長，放療組最短。結(jié)論喜泊分聯(lián)合放療對小鼠H22肝癌具有抑瘤增敏效果，且在一定范圍內(nèi)（5mg／kg～20mg／kg）其作用與藥物濃度呈正相關性；喜泊分聯(lián)合放療治療小鼠H22肝癌可延長小鼠生存期；其增敏機制可能與誘導細胞凋亡有關。

肝癌；喜泊分；抑瘤率；放射增敏；凋亡

1 材料與方法

1.1 實驗材料 鼠源性H22腹水型肝癌細胞株（河北醫(yī)科大學免疫實驗室提供）；6周齡健康雄性昆明小鼠（體重20～25 g，合格證號：1210050）；喜泊分（天津醫(yī)藥銷售有限公司，國藥準字號H20064306）；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；細胞凋亡試劑盒（南京凱基生物科技公司）；Elekta Synergy S直線加速器（英國Elekta Limited Company）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞株復蘇及傳代培養(yǎng) 將小鼠H22肝癌細胞從液氮中取出，置入37℃水浴中復蘇，將細胞懸液移入DMEM培養(yǎng)液離心管中離心，PBS洗滌細胞2次，在含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每2～3 d換液一次。觀察細胞形態(tài)及其生長狀態(tài)，當細胞生長達85%～90%融合時進行傳代。取生長良好的H22細胞，生理鹽水調(diào)整細胞濃度至5×107／mL。取3只昆明小鼠，腹部皮膚嚴格消毒，小鼠腹腔內(nèi)接種腫瘤細胞懸液0.5m L／只。腹腔接種后3 d即可見小鼠腹部增大，第7天明顯腫大，于小鼠右下腹部抽取腹水，生理鹽水稀釋至5×107／mL后再次進行腹腔傳代培養(yǎng)。以上所有操作均在超凈工作臺進行。

1.2.2 小鼠模型建立 參照文獻［3-4］，抽取第3代傳代7 d的H22肝癌細胞，用生理鹽水將腹水稀釋至約2×106個瘤細胞／mL，取健康昆明小鼠60只（10只備用），75%酒精消毒小鼠右前肢皮膚后皮下注射腫瘤細胞懸液0.2mL，接種時保證每只小鼠接種部位以及接種腫瘤細胞懸液量一致，觀察無瘤液溢出，送回飼養(yǎng)籠。接種后第7天結(jié)節(jié)平均體積可達到0.8 cm3左右，視為模型制作成功，模型制作成功率100%。選取腫瘤長徑為5.5～6.5mm左右結(jié)節(jié)形狀較規(guī)則、與肌肉皮膚無粘連小鼠用于實驗。

1.2.3 荷瘤小鼠隨機分組及處理 將荷瘤小鼠按隨機數(shù)字法分為5組，即對照組、單純放療組（避光10 h后腹腔麻醉狀態(tài)下給予5 Gy X線放療）、聯(lián)合Ⅰ組：小劑量Hp加放療組（Hp 5mg／kg尾靜脈注射，避光10 h后腹腔麻醉狀態(tài)下給予5 Gy X線放療；聯(lián)合Ⅱ組：中劑量Hp加放療組（Hp 15mg／kg尾靜脈注射，避光10 h后腹腔麻醉狀態(tài)下給予5 Gy X線放療）、聯(lián)合Ⅲ組：大劑量Hp加放療組（Hp 20mg／kg尾靜脈注射，避光10 h后腹腔麻醉狀態(tài)下給予5 Gy X線放療）。每組10只小鼠，各小鼠背部用皮膚墨水做好標記。

1.2.4 觀察腫瘤體積變化、計算腫瘤生長抑制率并繪制腫瘤生長曲線 治療開始后動態(tài)觀察各組腫瘤外觀、質(zhì)地、活動度等生長情況。用游標卡尺每隔1 d測量各處理組腫瘤的最長徑（LD）及最短徑（SD）并詳細記錄，直至治療開始后第14天。按照Steel經(jīng)驗公式計算腫瘤體積如下［5］：腫瘤體積V（mm3）＝LD×SD2／2。根據(jù)各組平均體積繪制腫瘤生長曲線。

1.2.5 腫瘤增敏q值 利用金正均法計算各聯(lián)合治療組q值［6］，計算公式如下：q＝E（A＋B）／（EA），其中 E（A＋B）表示各聯(lián)合治療組對腫瘤的生長抑制率，EA表示單純放療組對腫瘤的生長抑制率。

1.2.6 腫瘤抑制率 處理后第14天從每組隨機抽取4只荷瘤小鼠，稱取體重后，頸部脫臼法處死，立即用手術刀及眼科剪刀完整剝離腫瘤組織，對每塊腫瘤組織進行照片采集，電子分析天平稱重（g）并記錄，同時剝離各小鼠脾臟稱重（mg）并記錄。依據(jù)以下公式計算各實驗組荷瘤小鼠腫瘤抑制率（tumor inhibition，TIR）：TIR＝（對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重）／對照組平均瘤重×100%。

1.2.7 荷瘤小鼠生存期觀察并繪制生存曲線 治療第14 d各組剩余荷瘤小鼠不處死，等待其無干預病死，觀察各組小鼠生存期，計算其生命延長率，并繪制小鼠生存曲線。生命延長率計算公式如下［7］：生命延長率＝（治療組平均生存天數(shù)—對照組平均生存天數(shù)）／對照組平均生存天數(shù)×100%。

1.2.8 荷瘤小鼠腫瘤組織病理學檢查 參照文獻［8］將小鼠腫瘤組織保存、固定、浸蠟、包埋，制作臘塊，切片，HE常規(guī)染色，電子顯微鏡下分析各組小鼠腫瘤細胞形態(tài)學變化。

1.2.9 流式細胞儀檢測腫瘤細胞凋亡情況 參照文獻［9-10］將每組剝離腫瘤部分組織剪成腫瘤組織小塊，置于75%酒精4℃充分固定，經(jīng)研磨、過濾、離心、棄上清液、上機分析處理后上流式細胞儀檢測腫瘤組織凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0進行數(shù)據(jù)處理。單因素方差分析法進行方差齊性檢驗和統(tǒng)計分析，應用S-N-K檢驗對實驗數(shù)據(jù)進行多組間的兩兩比較分析。各組荷瘤鼠生存分析采用Kaplan-Meier法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腫瘤不同時間瘤體積及生長抑制率 各組小鼠移植瘤體積隨時間變化結(jié)果見圖1。各組小鼠植瘤生長抑制率隨時間變化結(jié)果見圖2。

2.2 腫瘤增敏q值 3個聯(lián)合治療組q值均大于1，說明3組均能延緩腫瘤生長，具有放療增敏作用，其中聯(lián)合治療 Ⅲ組q均值最大（見表1）。

表1 各聯(lián)合治療組q值比較Tab.1 Comparision of q values at different time points in different groups

2.3 腫瘤抑制率 第14天各治療組小鼠瘤重差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2）。

表2 各組第14天腫瘤抑制率Tab.2 The inhibitory rate of tumor grouth after 14 days in different groups

2.4 荷瘤小鼠生存期及生命延長率 治療后，聯(lián)合Ⅱ組小鼠生存時間與單純放療組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其余各組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義（見表3、圖3）。

表3 荷瘤小鼠生存期及生命延長率Tab.3 tumor-bearingmice survival rate and life extention

圖3 各組小鼠生存曲線Fig.3 Survival curves ofmice in each group

2.5 荷瘤小鼠腫瘤組織病理學檢查 對照組：腫瘤細胞體積較大，排列密集，細胞異形性明顯，核大深染，部分癌細胞呈癌巢狀排列。單純放療組：腫瘤細胞數(shù)目較對照組減少，排列較稀疏，形態(tài)不規(guī)則，可見少量壞死組織成分，呈現(xiàn)無組織紅染區(qū)。聯(lián)合治療組：各聯(lián)合治療組病理學表現(xiàn)大體相似。腫瘤細胞數(shù)目較其余兩組明顯減少，細胞體積變小，細胞核體積減小，以聯(lián)合治療Ⅲ組最明顯，組織中可見大量壞死成分，呈現(xiàn)大片無組織紅染區(qū)（見圖4）。

2.6 流式細胞儀檢測腫瘤細胞凋亡情況 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況（見圖5），各組凋亡率見表4。

圖4 各組移植瘤HE染色（×200）Fig.4 HE staining of xenografts in each group（×200）

圖5 流式細胞儀檢測各組移植瘤凋亡情況Fig.5 Flow cytometry apoptosis of tumor in each group

表4 各組腫瘤細胞凋亡情況Tab.4 Apoptosis rate indifferent groups

3 討論

HCC是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率較高的地區(qū)是亞洲和非洲東南部的一些國家。在我國肝癌發(fā)病率排名為第2位，僅次于肺癌。當前統(tǒng)計我國原發(fā)性肝癌患者人數(shù)占全世界發(fā)病總數(shù)的55%，死亡人數(shù)占全世界原發(fā)性肝癌死亡人數(shù)的45%。

肝切除術被認為是唯一根治原發(fā)性肝癌的治療方式，但由于該病發(fā)病比較隱匿，并且進展迅速，多數(shù)患者在就診時已達到不能進行手術治療的晚期。即使根治性切除，5年存活率僅為50%～62.7%，10年存活率為6.3%［11］，術后5年復發(fā)率在50%以上［12］，且仍以每年25%的速度遞增，復發(fā)高峰多在術后1～2年［13］。目前，原發(fā)性肝癌的非手術治療包括肝動脈栓塞化療術（transcatheter arterial chemoembolization）、射頻消融術射頻消融術（radiofrequency ablation）、經(jīng)皮酒精注射（percutaneous ethanol injection）、放射治療（radiotherapy）及靶向藥物治療等方法。放射治療已然成為肝癌一種重要的治療手段，但受到放射性肝損傷及肝臟對放射線耐受性差的限制，對比放射劑量與腫瘤控制和正常組織損傷的曲線，若要提高放療效果，不能無限的增加放射劑量。放射增敏劑可提高腫瘤細胞對放療的敏感性及放射線對腫瘤細胞的殺傷率，增強放療療效，為腫瘤放射治療的一個重要研究課題。然而目前還沒有令人滿意的放療增敏藥物應用于臨床［14-16］。

本實驗研究的光敏劑Hp易溶于水，便于給藥；可被電磁波激發(fā)發(fā)揮殺傷癌細胞的作用；同時具有對腫瘤的選擇性濃集作用；且對重要臟器無明顯不良反應，預期對腫瘤有更好的放射增敏效果。對其腫瘤放射增敏作用的研究是本次實驗的重點。因其應用尚未被廣泛認可，在進行該研究時有必要先采用動物實驗的方法探索合適的聯(lián)合方式及安全的用藥劑量。

本實驗結(jié)果顯示，Hp聯(lián)合放療對小鼠H22肝癌有一定的抑瘤增敏效果，與國內(nèi)學者夏云飛［17］、崔瑞耀［18］，國外學者Cohen［19］等研究結(jié)果一致。本研究顯示，Hp聯(lián)合放療治療小鼠H22肝癌可延長小鼠生存期；Hp放射增敏的可能機制是誘導細胞凋亡。本研究結(jié)果提示Hp有潛力成為一種新型的放療增敏藥物應用于臨床，為惡性腫瘤的治療提供了新的途徑。但Hp作為放療增敏劑聯(lián)合X線放療的劑量、放療分割方式、應用于臨床后的最佳藥物劑量及與放療的聯(lián)合方式等許多實際性問題仍有待進一步研究解決。

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（編校：吳茜）

Inhibitation and radiosensitization effects of hematoporphyrin and radiotherapy on H22 liver cancer m ice

LIUWei1，2，XU Xin3，LIU Yuan-yuan4，LIU Bin1Δ，WANG Xi-mei2

（1.Tumor Division，Hebei Provincial People’s Hospital，Shijiazhuang 050000，China；2.College of Nursing，HebeiMedical College School，
Shijiazhuang 050000，China；3.Department of emergency，Hebei Provincial People’s Hospital，Shijiazhuang 050000，China；4.Graduate School，HebeiMedical University，Shijiazhuang 050000，China）

ObjectiveTo observe the inhibitation and radiosensitization effect of hematoporphyrin and radiotherapy on H22 liver cancer mice.MethodsMicemodels of liver cancer were established by subcutaneous injection of H22 cells，tumor-bearingmice were randomly divided into：control group，simple radiotherapy group，small dose hematoporphyrin with radiotherapy group（combined treatment groupⅠ），middle dose hematoporphyrin with radiotherapy group（combined treatment groupⅡ），and high dose hematoporphyrin with radiotherapy group（combined treatment groupⅢ）.Tumor volumes，inhibition rate，sensitizing factor，the survival time ofmice，pathology，apoptosis and other indicators in five groups were observed after14 days.ResultsHematoporphyrin and radiotherapy can inhibit tumor growth in mice，The q values in three combined treatment groups were all above 1.0 at different time points，and combined treatmentgroupⅢ was the highest.The three combined treatment groups had higher apoptosis rate than control group and simple radiotherapy group，but the difference within groups were not statistically significant.The survival time in three combined treatment groupswere higher than control group，the combined treatment groupⅡ was the longest and simple radiotherapy group was the shortest.ConclusionHematoporphyrin has tumor inhibitition and radiation sensitizing effect on H22liver cancer mice，and the effect was positive correlation with drug dose.Hematoporphyrin combined with radiotherapy can extend the lifespan ofmice in H22liver cancer，its sensitizing mechanism may be association with induction of H22 cell apoptosis.

hepatocellular carcinoma；hematoporphyrin；inhibition rate；radiosensitization；apoptosis

R735.7

A

1005－1678（2014）03－0057－04

原發(fā)性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第六大常見惡性腫瘤（每年全世界新發(fā)病例＞60萬），并且居全世界癌癥相關死亡原因的第三位，每年約60萬人死于肝癌，在我國因原發(fā)性肝癌死亡人數(shù)占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%［1］。原發(fā)性肝癌起病隱匿、進展迅速，患者生存期短，預后極差，目前其5年生存率僅維持在3%～5%。肝癌的治療已成為全世界醫(yī)療界的挑戰(zhàn)，雖然肝癌根治性切除術后5年生存率可高達50%，但其術后3年復發(fā)率可達到45%左右，5年復發(fā)轉(zhuǎn)移率可高達60～70%［2］。化療及介入治療肝癌效果不太理想，新的靶向治療需配合局部治療才可能取得較好療效。目前肝癌治療方法不斷改進，總體來說，仍然很局限，在預防方面和治療手段的選擇上都不太成熟。本實驗通過對小鼠H22肝癌細胞移植瘤模型的研究，測試國產(chǎn)光敏劑血卟啉衍生物（Hematoporphyrin derivative，Hpd）喜泊分（hematoporphyrin，Hp）對X線照射的的抑瘤增敏作用，旨在探討喜泊分的作用機理，為光敏劑放療增敏和肝癌治療新途徑提供理論依據(jù)。

劉偉，女，碩士，講師，研究方向：臨床腫瘤學，E-mail：XYDH1980＠163.com；劉斌，通信作者，男，本科，教授，研究方向：腫瘤綜合治療，E-mail：273860690＠qq.com。