陳培勤，范鈺

（1.江蘇大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)系，江蘇 鎮(zhèn)江 212000；2.鎮(zhèn)江第一人民醫(yī)院 腫廇科，江蘇 鎮(zhèn)江 212000）

M icroRNAs在胰腺癌早期診斷中的應(yīng)用研究

陳培勤1，范鈺2Δ

（1.江蘇大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)系，江蘇 鎮(zhèn)江 212000；2.鎮(zhèn)江第一人民醫(yī)院 腫廇科，江蘇 鎮(zhèn)江 212000）

目的分析MicroRNAs在胰腺癌早期診斷中應(yīng)用的臨床價值。方法3種胰腺癌細(xì)胞系PANC-1、PaCa-2、AsPC-1和正常胰腺細(xì)胞以及胰腺癌患者100例和正常志愿者100例血漿，采用Real-time PCR檢測mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表達(dá)量，并進(jìn)行統(tǒng)計分析；分別取胰腺癌組織100例，正常胰腺胰腺組織100例，采用免疫組化從組織水平檢測mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表達(dá)量，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，與正常胰腺細(xì)胞相比較，PANC-1、PaCa-2、AsPC-1 3種胰腺癌細(xì)胞中mir-155、mir-196a的表達(dá)量均明顯增高（P＜0.05）；與健康志愿者血漿相比，胰腺癌患者血漿中mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表達(dá)明顯增高（P＜0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，胰腺癌組織中 mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表達(dá)明顯高于其在正常胰腺組織中的表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)論胰腺癌細(xì)胞系和胰腺癌組織中均高表達(dá)mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b，說明其與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，這些特異性的MicroRNAs有望成為胰腺癌早期診斷的標(biāo)記物，有極高的診斷價值和廣闊的臨床應(yīng)用前景。

胰腺癌；microRNAs；RT-PCR；免疫組化；早期診斷

1 材料與方法

1.1 材料 胰腺癌細(xì)胞系PANC-1、PaCa-2、AsPC-1以及正常胰腺細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。RT-PCR儀（美國Bio—Rad公司）。一抗抗MMP-2抗體、二抗羊抗兔抗體（美國Sigma公司），Trizol提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國QIAGEN公司）。胰腺癌組織100例和正常胰腺組織100例。胰腺癌患者100例，健康志愿者100例，所有患者均充分了解此次研究的利弊，并簽署知情同意書，愿意配合研究中的各項工作，本研究獲得了醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)?；颊吣挲g20～73歲，平均（47.1±6.3）歲。胰腺癌患者和健康志愿者在年齡、性別構(gòu)成比等基本資料方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR檢測 將3種胰腺癌細(xì)胞系PANC-1、PaCa-2、AsPC-1、正常胰腺細(xì)胞采用 Real-time PCR檢測 mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表達(dá)量。mir-155引物序列，上游：5’-GTCCCAATGCTGTCT-3’，下 游：5’-GGAAGTTGCATGCAT-3’，mir-196a引 物 序列，上游：5’-GTGGAGTCGTCCCTGA-3’，下 游：5’-AATGCTGTCTGTGGA-3’，mir-181a引物序列，上游：5’-GCCAATGCTGTGTGA-3’，下游：5’-GAATGCTGTCTTGGA-3’，mir-181b引物序 列，上 游：5’-TCTGTGGAGTCAATG-3’，下 游：5’-GTCTGTGGATTTGCA-3’，內(nèi)參引物序列，上游：5’-CTTAGTTGCATGCAG-3’，下游：5’-AATCGTGTATAAGTC-3’，所有引物均由捷瑞生物引物合成公司合成。將胰腺癌患者和健康志愿者抽取2 mL血液放入加抗凝劑的試管中，靜置1 h后離心，取上清液即為血漿。Real-time PCR過程：①采用Trizol提取試劑提取細(xì)胞和血漿總RNA，并進(jìn)行質(zhì)量鑒定，紫外分光光度計法測量總RNA樣品在260 nm和280 nm處的吸光度值，如果樣品A260／A280值在1.8～2.0之間，表明RNA純度較高，無蛋白質(zhì)和DNA等污染，可進(jìn)行后續(xù)實驗。②將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，進(jìn)行熒光PCR擴增。擴增程序為95℃、15min，94℃、15S，55℃、30 S，72℃、30 S，共 40個循環(huán)。檢測 mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表達(dá)量。

1.2.2 免疫組化檢測 采用免疫組化法檢測胰腺癌組織和正常胰腺組織中 mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表達(dá)量。

具體步驟如下：①配置 PBS緩沖液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol／L，KCl 12.7 mmol／L，Na2HPO44.3 mmol／L，KH2PO4 1.4mmol／L；配置 0.01 mol／L檸檬酸鈉緩沖液（CB，pH6.0）：檸檬酸三鈉3 g，檸檬酸0.4 g。②脫蠟和水化：脫蠟前應(yīng)將組織切片在60℃恒溫箱中烘烤30分鐘。先將組織切片至于二甲苯中浸泡10min，更換二甲苯后再浸泡10min；隨后在無水乙醇中浸泡5min；95%乙醇中浸泡5min，75%乙醇中浸泡5min；③抗原修復(fù)：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織切片：mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b含量測定使用胰酶修復(fù)。具體過程為：滴加0.1%胰酶，37℃消化。

TIMP-1含量測定使用抗原熱修復(fù)方式。具體過程為：微波爐加熱在微波爐里加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）至沸騰后將組織切片放入，斷電，間隔5～10min，反復(fù)1～2次 2）免疫組化染色SP法脫蠟、水化PBS洗2～3次，每次5 min 3%H2O2（80%甲醇）滴加在組織切片上，室溫靜置10minPBS洗2～3次，每次5min?？乖迯?fù)PBS洗2～3次，每次5min滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min，甩去多余液體滴加I抗50 uL，4℃冰箱濕盒過夜4℃過夜后37℃烘箱中復(fù)溫45 minPBS洗3次，每次5min滴加II抗50 uL，37℃1 h，II抗中可加入0.05%的tween-20 PBS洗3次，各5min，DAB顯色5～10min，在顯微鏡下觀察染色程度PBS或自來水沖洗10min，蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化，自來水沖洗10～15min脫水、透明、鏡檢、封片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 15.0處理數(shù)據(jù)，正態(tài)計量資料用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種胰腺癌細(xì)胞系以及正常胰腺細(xì)胞中mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表達(dá)結(jié)果 與正常胰腺細(xì)胞相比較，3種胰腺癌細(xì)胞系中mir-155以及mir-196a的表達(dá)均明顯高于其在正常胰腺細(xì)胞中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但3種胰腺癌細(xì)胞系中mir-181a、mir-181b的表達(dá)與正常胰腺癌細(xì)胞相比，無顯著性差異（見表1）。

表1 PANC-1、PaCa-2、AsPC-1以及正常胰腺細(xì)胞中mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表達(dá)Tab.1 The expression ofmir-155，mir-196a，mir-181a，mir-181b in PANC-1，PaCa-2，AsPC-1 and normal pancreatic cells

2.2 胰腺癌患者與健康志愿者血漿中mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表達(dá)結(jié)果 RT-PCR結(jié)果顯示：健康志愿者血漿中 mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表達(dá)量均明顯高于胰腺癌患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

表2 胰腺癌患者與健康志愿者血漿中mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表達(dá)Tab.2 The expression ofmir-155，mir-196a，mir-181a，mir-181b in the plasma of pancreatic cancer patients and healthy volunteers

2.3 胰腺癌與正常胰腺組織中mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表達(dá)結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示：胰腺癌組織中mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表達(dá)均明顯高于其在正常胰腺細(xì)胞中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。正常胰腺組織中 mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b表達(dá)量很少，顏色呈淡蘭色。胰腺癌組織中 mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b表達(dá)量增加，顏色較正常組織偏深（見圖1）。

表3 胰腺癌組織與正常胰腺組織中mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b表達(dá)結(jié)果的比較Tab.3 The expression ofmir-155，mir-196a，mir-181a，mir-181b in pancreatic cancer tissues and normal pancreatic tissue

圖1 胰腺癌組織與正常胰腺組織中mir-155、mir-196a、mir-181b表達(dá)Fig.1 The expression ofmir-155，mir-196a，mir-181a，mir-181b in pancreatic cancer tissues and normal pancreatic tissue

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，某些microRNAs異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系［7-8］。與正常組織比較，胰腺癌組織中可見多種miRNA的表達(dá)紊亂［9-10］。因此有必要分析MicroRNAs在胰腺癌早期診斷中應(yīng)用的臨床價值。由結(jié)果也可以看出，無論是胰腺癌細(xì)胞系還是胰腺癌血漿以及胰腺癌組織，miR-155、miR-196a在胰腺癌細(xì)胞株和胰腺癌中均顯著高表達(dá)。通過與正常胰腺細(xì)胞相比較，PANC-1、PaCa-2、AsPC-1 3種胰腺癌細(xì)胞中 mir-155、mir-196a的表達(dá)量均顯著增高（P＜0.05）；但 3種細(xì)胞中 mir-181a、mir-181b的表達(dá)量與正常胰腺細(xì)胞無明顯差別。與健康志愿者血漿相比較，胰腺癌患者血漿中 mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表達(dá)均顯著增高（P＜0.05）。日本學(xué)者采用ERCP的方法收集了術(shù)前胰腺導(dǎo)管腺癌以及慢性胰腺炎患者的胰液，并對miRNA-155的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這種miRNA在胰腺癌患者中的表達(dá)均高于慢性胰腺炎患者［11-12］。本實驗通過免疫組化結(jié)果顯示，胰腺癌組織中 mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表達(dá)顯著高于其在正常胰腺組織中的表達(dá)（P＜0.05）。也有研究者同樣證實了 mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的異常表達(dá)與胰腺癌之間的關(guān)系［13］。綜上所述，大量的實驗研究表明：特異性miRNA的異常表達(dá)與胰腺癌有密切的關(guān)系，一些miRNA在胰腺癌細(xì)胞、血漿以及組織中高表達(dá)，應(yīng)值得廣大研究者的注意，對早期胰腺癌的檢出具有重要的意義。miRNA在胰腺癌中作為一種潛在的腫瘤標(biāo)記志物，有極高的診斷價值和廣闊的臨床前景的。

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（編校：吳茜）

M icroRNAs in the early diagnosis of pancreatic cancer

CHEN Pei-qin1，F(xiàn)AN Yu2Δ

（1.Clinical Medicine，Department of Jiangsu University，Zhenjiang 212000，China；2.Department of Tumor，The First People’Hospital of Zhenjiang，Zhenjiang 212000，China）

ObjectiveTo analyze the clinical value ofmicroRNAs applied in the early diagnosis of pancreatic cancer.MethodsThe expression of mir-155，mir-196a，mir-181a，mir-181b in three pancreatic cancer cell lines PANC-1，PaCa-2，AsPC-1 pancreatic cancer，normal pancreatic cells and plasmas of 100 patientswith pancreatic cancer，100 normal volunteerswere detected by Real-time PCR，and the resultswere analyzed.The expression of mir-155，mir-196a，mir-181a，mir-181b in 100 pancreatic cancer tissues and 100 normal pancreatic tissueswere detected by immunohistochemical，and the resultswere analyzed.ResultsReal-timePCR test results showed that compared with normal pancreatic cells，mir-155，mir-196a expression in three pancreatic cancer cells PANC-1，PaCa-2，AsPC-1 were significantly increased（P＜0.05）.Compared with healthy volunteers，mir-155，mir-196a，mir-181a，mir-181b expression of plasma in pancreatic cancer patientswere significantly higher（P＜0.05）.Immunohistochemistry results showed thatmir-155，mir-196a mir-181a and mir-181b expression in pancreatic tissue were significantly higher than that in normal pancreatic tissue（P＜0.05）.ConclusionThe expression ofmir-155，mir-196a，mir-181a andmir-181b are high in pancreatic cancer tissues and pancreatic cancer cell lines，which are closely related to the development of pancreatic cancer.Those microRNAs are expected to be cancer markers for early diagnosis of，pancreatic cancer，have highly diagnostic value and broad clinical application.

pancreatic cancer；microRNAs；RT-PCR；immunohistochemistry；early diagnosis

R446.1

A

1005－1678（2014）03－0052－03

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，胰腺癌早期的癥狀不典型，與慢性胰腺炎癥狀類似，不易被檢出［1］，一旦被檢出胰腺癌大多為晚期，晚期胰腺癌患者的預(yù)后極差，因此及時檢出胰腺癌，對提高患者的生活質(zhì)量至關(guān)重要［2-4］。MicroRNAs是一種內(nèi)源性的，短片段的非編碼RNA，其長度約為17～22個核苷酸，它通過特異性識別靶基因3’端或5’端非翻譯區(qū)并與之結(jié)合從而調(diào)控靶基因的表達(dá)［5-6］。本研究分別從細(xì)胞水平和組織水平，采用Real-time PCR和免疫組化技術(shù)檢測3種胰腺癌細(xì)胞、胰腺癌患者血漿及組織中microRNAs的表達(dá)情況，旨在為早期胰腺癌的診斷提供依據(jù)。

江蘇省衛(wèi)生廳中青年扶持計劃（JW-2010BNO.019）

陳培勤，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：急性肺損傷發(fā)病機制與防治；范鈺，通信作者，男，博士，副教授，研究方向：消化道腫瘤的基礎(chǔ)與臨床，E-mail：jsdxcpqin＠126.com。