胡軍，胡名松，曾慰，劉翔，鄭達(dá)揚(yáng)，高文奎

（南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院 心胸外科，湖南 衡陽(yáng) 421001）

異硫氰酸苯乙酯通過(guò)上調(diào)PTEN表達(dá)誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡

胡軍，胡名松，曾慰，劉翔，鄭達(dá)揚(yáng)，高文奎

（南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院 心胸外科，湖南 衡陽(yáng) 421001）

目的研究異硫氰酸苯乙酯（phenethyl isothiocyanate，PEITC）抑制肺癌細(xì)胞NCI-H446生長(zhǎng)的機(jī)制。方法體外培養(yǎng)肺癌NCI-H446細(xì)胞，并分為對(duì)照組和PEITC處理組。對(duì)照組細(xì)胞給予0.1%二甲基亞砜處理，PEITC組分別用10μmol／L、30μmol／L和50μmol／L PEITC作用24 h，噻唑藍(lán)法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞的增殖與凋亡；Western blot檢測(cè)Akt磷酸化、細(xì)胞內(nèi)活性caspase-3和caspase-9的表達(dá)以及胞漿中細(xì)胞色素C的含量；Real time PCR檢測(cè)磷酸酯酶與張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homologue，PTEN）mRNA水平。結(jié)果PEITC可顯著抑制肺癌NCI-H446細(xì)胞增殖（P＜0.05），并誘導(dǎo)其凋亡。PEITC處理后，肺癌細(xì)胞內(nèi)活性caspase-3和caspase-9含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；同時(shí)，PEITC處理后，肺癌細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C含量明顯增高（P＜0.05）。PEITC也能抑制NCI-H446細(xì)胞中Akt的磷酸化水平。此外，PEITC處理后，可明顯誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞內(nèi)PTEN表達(dá)的增加（P＜0.05），其中50μmol／L PEITC處理后，PTEN mRNA含量增高了4.6倍。結(jié)論P(yáng)EITC能抑制NCI-H446肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，其機(jī)制可能通過(guò)上調(diào)PETN表達(dá)，從而抑制PI3K／Akt的活性有關(guān)。

異硫氰酸苯乙酯；肺腫瘤，細(xì)胞系；磷酸酯酶與張力蛋白同源物；凋亡

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 PEITC（純度≥95%）購(gòu)自LKT Laboratories，并用二甲基亞砜溶解；細(xì)胞培養(yǎng)基和 Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；細(xì)胞蛋白提取試劑盒購(gòu)自Thermo公司；碘化丙啶（PI）購(gòu)自Sigma公司；抗PTEN抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；磷酸化Akt、總Akt抗體購(gòu)自Cell Signaling公司；ECl化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自 Amersham Pharmacia公司。主要儀器：流式細(xì)胞儀（FACSCalibur system，BD），分 光 光 度 計(jì) （BioPhotometer spectrophotometer，Eppendorf），實(shí)時(shí)定量 PCR儀（7500，ABI）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及活性檢測(cè) 人小細(xì)胞NCI-H446肺癌細(xì)胞株（購(gòu)自中南大學(xué)腫瘤研究所）用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。分別設(shè)立對(duì)照組（加入等體積的二甲基亞砜）及不同濃度PEITC處理組（加入終濃度為10、30和50μmol／L的PEITC作用24 h）。采用噻唑藍(lán)染色法觀察PEITC對(duì)NCI-H466細(xì)胞的增殖情況，即NCI-H466孵育結(jié)束后，每孔加入30μL噻唑蘭（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）溶液（1 g／L）孵育 2 h。棄上清，并加入 200μL二甲基亞砜，充分混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度值（A570），并計(jì)算抑制率。抑制率＝（對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值）／對(duì)照組A值×100%。

1.3 凋亡檢測(cè) NCI-H446細(xì)胞孵育結(jié)束后，棄上清，PBS輕洗2次，重懸制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度至5×105／mL。取1mL細(xì)胞，1000 r／min離心 5 min，離心棄上清；用195μL Binding Buffer輕重懸并加入5μL Annexin-V／FITC輕混勻，室溫避光孵育10min；1000 r／min離心5min，沉淀加入190μL Annexin-V／FITC結(jié)合液輕重懸細(xì)胞，再加入10μL PI輕輕混勾，冰浴避光反應(yīng)10min后用于流式細(xì)胞術(shù)分析。

1.4 Real-time PCR分析 采用定量RT-PCR檢測(cè)PTEN的表達(dá)。細(xì)胞處理完畢，用Trizol試劑提取總RNA，取2μg RNA用于PTENmRNA分析。擴(kuò)增PTEN和GAPDH所用引物分別為：5’-AAGTCCAGAGCCATTTCC-3’（正向）和 5’-AATATAGGTCAAGTCTAAGTCG-3’，和 5’-GCGAGAAGATGACCCAGATC-3’（正向）和5’-GGATAGCAACGCCTGGATAG-3’。反應(yīng)條件是：94℃ 3min，和94℃30s，50℃ 30 s，72℃ 30s，總共 45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在 ABI prism 7700上進(jìn)行。所得的數(shù)據(jù)與內(nèi)參GAPDH之比作為相對(duì)值。

1.5 Western blot 細(xì)胞處理完畢后，800 r／min離心5min，棄上清，冰冷的PBS洗滌細(xì)胞2次。加入200μL細(xì)胞裂解緩沖液重懸浮細(xì)胞，冰上裂解40min。1000 r／min離心15min后，上清即為細(xì)胞總蛋白。對(duì)于細(xì)胞漿蛋白提取，將細(xì)胞沉淀每20μL細(xì)胞沉淀的體積，加入200μL預(yù)冷的溶液A工作液，最大轉(zhuǎn)速渦旋劇烈振蕩10s。放置冰上10～15min。隨后加入11μL冷溶液 B，渦旋劇烈振蕩5s，冰上裂解1min。再次振蕩5s后，4℃離心5min）。上清即為細(xì)胞漿蛋白。上述蛋白經(jīng)5%～15%SDSPAGE后，Western blot檢測(cè) caspase-3，caspase-9，Akt和細(xì)胞色素C的表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)步驟重復(fù)3次，采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，正態(tài)計(jì)量資料用“±s”表示；多組之間的對(duì)比采用單因素方差分析，2組間對(duì)比使用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PEITC對(duì)NCI-H446細(xì)胞增殖的影響 NCI-H446細(xì)胞經(jīng)過(guò)10、30和50μmol／L PEITC處理0～48 h后，細(xì)胞的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖1。從抑制曲線可以看出，48 h后，10、30和 50μmol／L PEITC對(duì) NCI-H446細(xì)胞的抑制率分別為9.8%，24.6%和41.5%。與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 PEITC對(duì)NCI-H446細(xì)胞增殖的影響1.對(duì)照組；2.10μmol／L PEITC；3.30μmol／L PEITC；4.50μmol／L PEITC；*P＜0.05，與對(duì)照組相比Fig.1 Effects of PEITC on the proliferation of NCI-H4461.Control group；2.10μmol／L PEITC；3.30μmol／L PEITC；4.50μmol／L PEITC*P＜0.05，compared with control group

2.2 PEITC對(duì)NCI-H446細(xì)胞凋亡的影響 V-FITC／PI染色結(jié)果顯示，30和50μmol／L PEITC處理NCI-H446細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率分別為（16.7±3.84）%和（46.2±4.62）%，見(jiàn)圖2。

2.3 PEITC對(duì)NCI-H446細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Western blot結(jié)果顯示，30和 50μmol／L PEITC處理后，細(xì)胞內(nèi)

圖2 PEITC對(duì)NCI-H446細(xì)胞凋亡的影響1.對(duì)照組；2.10μmol／L PEITC；3.30μmol／L PEITC；4.50μmol／L PEITC*P＜0.05，與對(duì)照組相比Fig.2 Effects of PEITC on the apoptosis of NCI-H4461.Control group；2.10μmol／L PEITC；3.30μmol／L PEITC；4.50μmol／L PEITC*P＜0.05，compared with control group

cleaved caspase-3和cleaved caspase-9含量顯著高于對(duì)照組。同時(shí)，細(xì)胞漿中細(xì)胞色素C含量也顯著高于對(duì)照組（見(jiàn)圖3）。

圖3 PEITC對(duì)活性caspase-3，caspase-9以及細(xì)胞色素C的影響1.對(duì)照組；2.10μmol／L PEITC；3.30μmol／L PEITC；4.50μmol／L PEITCFig.3 Effect of PEITC on expression of cleaved caspase-3，caspase-9，and cytochrome1.Control group；2.10μmol／L PEITC；3.30μmol／L PEITC；4.50μmol／L PEITC

2.4 PEITC對(duì)Akt磷酸化的影響 NCI-H446細(xì)胞中Akt磷酸化水平較高，經(jīng)不同濃度PEITC處理后，磷酸化Akt含量逐漸降低，而總Akt含量保持不變（見(jiàn)圖4）。

圖4 PEITC對(duì)NCI-H446細(xì)胞活性Akt磷酸化的影響1.對(duì)照組；2.10μmol／L PEITC；3.30μmol／L PEITC；4.50μmol／L PEITCFig.4 Effects of PEITC on Akt phosphorylation in NCI-H446 cells1.Control group；2.10μmol／L PEITC；3.30μmol／L PEITC；4.50μmol／L PEITC

2.5 PEITC對(duì)PTEN表達(dá)的影響 Real-time PCR結(jié)果顯示，10～50μmol／L PEITC處理后，PTEN mRNA含量隨著 PEITC濃度的增高而增高。其中50μmol／L PEITC處理后，與對(duì)照組相比，PTEN mRNA含量增高了4.6倍（見(jiàn)圖5）。

圖5 PEITC對(duì)NCI-H446表達(dá)PTEN的影響1.對(duì)照組；2.10μmol／L PEITC；3.30μmol／L PEITC；4.50μmol／L PEITC；*P＜0.05，與對(duì)照組相比Fig.5 Effecst of PEITC on the PTEN expression in NCI-H4461.Control group；2.10μmol／L PEITC；3.30μmol／L PEITC；4.50μmol／L PEITC*P＜0.05，compared with control group

3 討論

PEITC是從藥用植物中的漿果，葉，花，果實(shí)中得到的五環(huán)三萜化合物，研究顯示，PEITC對(duì)多種惡性腫瘤具有抑制作用［7-8］。然而，PEITC抗肺癌的分子機(jī)制還沒(méi)有完全清楚。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PEITC能夠以劑量依賴性方式抑制人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H446的增殖。同時(shí)也能誘導(dǎo)NCI-H446細(xì)胞的凋亡。其機(jī)制可能通過(guò)激活線粒體凋亡途徑，并抑制PI3K／Akt的通路的激活有關(guān)。

在與腫瘤生長(zhǎng)分化的眾多相關(guān)信號(hào)通路中，PI3K／Akt信號(hào)發(fā)揮重要作用通路最為重要。研究顯示，肺癌細(xì)胞中，Akt信號(hào)通路往往呈異常激活狀態(tài)［9］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用PEITC處理NCI-H446后，Akt的磷酸化水平顯著降低，這表明PEITC對(duì)細(xì)胞的抑制作用可能與抑制Akt的磷酸化有關(guān)。對(duì)于抗腫瘤藥物而言，誘導(dǎo)細(xì)胞細(xì)胞凋亡是其最終的目標(biāo)［10］。細(xì)胞凋亡主要有死亡受體途徑和線粒體途徑。細(xì)胞凋亡信號(hào)最終需要caspase酶的激活而執(zhí)行［11］。目前已發(fā)現(xiàn)的 caspase有10種，其中以caspase-3和caspase-9最為重要。其中caspase-3是參與細(xì)胞凋亡潛在機(jī)制的關(guān)鍵分子，是凋亡執(zhí)行的最終效應(yīng)分子。caspase-9不但是凋亡的啟動(dòng)分子，同時(shí)也是執(zhí)行凋亡的效應(yīng)分子。Akt可通過(guò)磷酸化其Ser196而抑制其活性［12］。既然PEITC可抑制Akt的活性，那么，PEITC是否也能影響caspase-3和caspase-9的激活呢？本研究中結(jié)果顯示：用PEITC處理NCI-H446細(xì)胞后，活性caspase-3和caspase-9含量顯著增高。此外，不同濃度的PEITC也可誘導(dǎo)細(xì)線粒體內(nèi)胞色素C釋放至細(xì)胞質(zhì)中。因此PEITC誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡可能與抑制caspase-3和caspase-9的活性以及促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放有關(guān)。為了進(jìn)一步明確Akt失活的機(jī)制，我們隨后對(duì)PTEN的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。PTEN是一種蛋白質(zhì)和脂質(zhì)雙磷酸酶。它的主要靶點(diǎn)是PI3K的的代謝產(chǎn)物PIP3。在多種腫瘤細(xì)胞中，PTEN表達(dá)往往呈缺失狀態(tài)，隨后導(dǎo)致PIP3在細(xì)胞內(nèi)蓄積，并發(fā)揮模擬PI3K的活化狀態(tài)而發(fā)揮效應(yīng)［13-14］。本研究采用real time-PCR證實(shí)，PEITC處理的NCI-H446細(xì)胞后，可顯著上調(diào)PTEN mRNA水平。這表明PEITC能上調(diào)NCIH446細(xì)胞中PTEN的表達(dá)，從而抑制PI3K／Akt途徑的激活，最終調(diào)控下游區(qū)效應(yīng)器而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［15］。因此，PEITC可能是一種有效的抗肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)藥物，具有使PTEN基因上調(diào)誘導(dǎo)生長(zhǎng)停滯和凋亡的能力。

綜上所述，研究結(jié)果表明，PEITC通過(guò)上調(diào)PTEN基因表達(dá)，從而抑制NCI-H446細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡。這表明PTEN可能是治療肺癌的一個(gè)新靶點(diǎn)，PEITC可通過(guò)影響PTEN的表達(dá)從而發(fā)揮抗腫瘤作用。在隨后研究當(dāng)中，我們將通過(guò)建立異種移植瘤動(dòng)物模型，進(jìn)一步觀察PEITC的抗腫瘤活性。

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（編校：李璐璐）

Phenethyl isothiocyanate induces human lung cancer cells apoptosis through up-regulating PTEN expression

HU Jun，HU Ming-song，ZENGWei，LIU Xiang，ZHENG Da-yang，GAOWen-kui
（Department of Cardiothoracic surgery，The Second Affiliated Hospital of Nanhua University，Hengyang 421001，China）

ObjectiveTo investigate the anti-proliferation mechanisms of Phenethyl isothiocyanate（PEITC）in human lung cancer cells line NCIH446.MethodsHuman lung cancer cell line NCI-H446 was cultured in vitro，and treated with 10，30，50μmol／L PEITC for 24 h respectively.Cell viability and apoptosiswere analyzed by methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide（MTT）assay and flow cytometry，respectively.Phosphorylation of Akt，activation of caspase-3 and caspase-9 in NCI-H446 cells，and production of cytochrome C in cytoplasm were detected byWestern blot.Expression of phosphatase and tensin homologue（PTEN）was detected by real-time PCR.ResultsPEITC significantly reduced NCI-H446 cells proliferation in dose-dependentmanner（P＜0.05），and apoptosiswas also inducted after PEITC administration.PEITC alsomarkedly induced expression of caspase-3 and caspase-9，as compared with control group.And the level of cytochrome C in the cytoplasm was also increased after treatment with PEITC.Furthermore，PEITC treatment significantly increased themRNA level of PTEN in NCI-H446 cells.ConclusionPEITCmay be used as a potential antilung cancer agent by regulationg PI3K／AKT pathway and increasing PETN expression.

phenethyl isothiocyanate；lung neoplasm；cell line；phosphatase and tensin homologue；apoptosis

R734.2

A

1005－1678（2014）03－0037－04

異硫氰酸苯乙酯（phenethyl isothiocyanate，PEITC）是從橄欖、花椰菜等十字花科植物中提取出來(lái)的一種異硫氰酸酯類物質(zhì)［1］。研究顯示，PEITC可通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮對(duì)腫瘤的拮抗作用，包括與β-微管蛋白結(jié)合，促進(jìn)微管蛋白的穩(wěn)定而使細(xì)胞阻滯于 G2／M期［2］。此外，PEITC也能抑制去乙酰化酶的活性［3］。而且，體內(nèi)外毒性實(shí)驗(yàn)顯示PEITC對(duì)正常組織細(xì)胞無(wú)明顯的不良反應(yīng)［4］。然而，PEITC是否促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖，及其可能的分子機(jī)制還沒(méi)有完全清楚。磷酸酯酶與張力蛋白同源物（phosphataseand tensin homologue，PTEN）是一種由PTEN基因編碼的蛋白，PTEN可誘導(dǎo)磷酸肌醇底物去磷酸化，通過(guò)降低胞內(nèi)磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（phoSphatidylinositol-3-phosphate，PIP3）的水平，從而負(fù)向調(diào)節(jié)體內(nèi)PI3K／Akt激酶的活性，最終發(fā)揮對(duì)腫瘤的抑制作用［5］。許多腫瘤細(xì)胞中，PI3K／Akt異常激活與細(xì)胞周期進(jìn)展、遷移、增殖、代謝和血管生成密切相關(guān)［6］。因此，通過(guò)外源性藥物干預(yù)，上調(diào)PTEN的活性，有可能是腫瘤治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。本研究旨在探討PEITC對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞PTEN的表達(dá)的影響，以及PEITC是否通過(guò)影響PI3K的活性而發(fā)揮抗腫瘤的作用。

湖南省自然科學(xué)基金（13JJ4079）

胡軍，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：心胸外科疾病診斷與防治，E-mail：hujun0207＠sina.com。