白楊，陳浩，李紀(jì)政，黃進(jìn)團(tuán)，楊祖立

（中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院 胃腸外科，廣東 廣州 510655）

ADAM 8基因調(diào)控AKT／m TOR通路對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT8的影響

白楊，陳浩，李紀(jì)政，黃進(jìn)團(tuán)，楊祖立Δ

（中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院 胃腸外科，廣東 廣州 510655）

目的探討解整合素樣金屬蛋白酶8（a disintegrin and metalloprotease domain 8，ADAM8）基因?qū)Y(jié)腸癌HCT8細(xì)胞增殖及增殖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑PI3K-Akt-mTOR的影響。方法體外培養(yǎng)結(jié)腸癌HCT8細(xì)胞，構(gòu)建含ADAM8基因過表達(dá)質(zhì)粒載體和ADAM8基因RNA干擾質(zhì)粒載體；轉(zhuǎn)染至HCT8細(xì)胞，分為過表達(dá)組、干擾組和對照組。采用EdU和MTS方法檢測細(xì)胞增殖情況，PI3K酶活檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)PI3K酶活，Western Blot方法檢測細(xì)胞內(nèi)Akt、p-Akt相對表達(dá)量和mTOR的表達(dá)量。結(jié)果過表達(dá)組細(xì)胞增殖能力（1.22±0.13）顯著高于對照組（1.00±0.12）（P＜0.05），干擾組細(xì)胞增殖能力（0.78±0.11）顯著低于對照組（1.00±0.12）（P＜0.05）。與對照組相比，過表達(dá)組和干擾組細(xì)胞內(nèi)PI3K的酶活變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ADAM8過表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)p-Akt和mTOR表達(dá)量均增加，干擾表達(dá)后p-Akt和mTOR表達(dá)量均降低。結(jié)論ADAM8可通過增強(qiáng)Akt的磷酸化和mTOR的表達(dá)促進(jìn)HCT8細(xì)胞增殖。

解整合素樣金屬蛋白酶8；結(jié)腸癌；免疫印跡；干擾表達(dá)

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及主要實(shí)驗(yàn)儀器 結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT8購自中科院上海生化細(xì)胞所細(xì)胞庫。包含ADAM8序列的載體質(zhì)粒購自吉凱基因公司（GOSE38134）。質(zhì)粒小抽試劑盒購自biomiga（PD1212-01）。EdU檢測試劑盒購自廣州銳博生物。MTS（CellTiter 96 AQueous One Solution細(xì)胞增殖試劑盒）購自美國Promega公司。其他試劑（如轉(zhuǎn)染試劑等）均購自 Life Technology。PI3-Kinase Activity AlphaScreen?Assay Kit（貨號：K-1300）購自 echelon公司。主要抗體：mouse monoclonal anti-ADAM8 antibody（ab89127，abcam，UK），rabbit anti-p-Akt（＃4060；Cell signaling Technology），Akt（pan）（40D4）Mouse mAb（＃2920；Cell signaling Technology），mTOR（7C10）RabbitmAb（＃2983P；Cell signaling Technology），mouse anti-GAPDH （sc-32233；Santa Cruz Biotechnologies，USA）。

主要實(shí)驗(yàn)儀器：萊卡 DMI4000B智能型倒置熒光顯微鏡（Leica Micro-systems，Germany）；酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific，USA）；ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀（Applied Biosystems，USA）；Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（LI-COR，USA）；DU-730紫外／可見分光光度計(jì)（BECKMAN，USA）；Eppendorf 5418小型高速離心機(jī)（Eppendorf，Germany）；生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，USA）；Forma SeriesⅡCO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific，USA）；ME103E／02型電子天平（METTLER TOLEDO，USA）。

1.2 載體構(gòu)建 由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成ADAM8過表達(dá)載體和ADAM8 RNA干擾載體的構(gòu)建和鑒定，命名為ADAM8 overexpression plasmid和ADAM8 RNAi plasmid。其中ADAM8 RNAi plasmid載體上攜帶的片段為 5’-TCACAGGGCTAGCAGTGTGGGT-3’，可 以 轉(zhuǎn) 錄 為 5’-UCACAGGGCUAGCAGUGUGGGU-3’（由吉凱基因公司提供），轉(zhuǎn)錄的RNA片段可以特異性地結(jié)合ADAM8。ADAM8 overexpression plasmid載體上攜帶有ADAM8 ORF片段，可以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)ADAM8。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT8常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃，飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中，3～4d傳代一次。取對數(shù)生長期細(xì)胞，按一定濃度接種培養(yǎng)用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 分組和處理方法 將體外培養(yǎng)的HCT8細(xì)胞分成3組，分別為對照組、過表達(dá)組和干擾表達(dá)組。其中對照組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒。過表達(dá)組則轉(zhuǎn)染ADAM8 overexpression plasmid，干擾組轉(zhuǎn)染 ADAM8 RNAi plasmid。按照 Lipofectamine?LTX＆Plus Reagent操作手冊：使用150μL Opti-MEM培養(yǎng)基（FBS free）稀釋5μL Lipofectamine LTX試劑，使用 150μL Opti-MEM培養(yǎng)基（FBS free）稀釋3μg質(zhì)粒DNA溶液 并加入5μLPlus試劑，然后將2種稀釋液混合，并室溫孵育5min，最后將上述混合液加入至六孔板中。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。于37℃，飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h時(shí)進(jìn)行相應(yīng)檢測。

1.5 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 細(xì)胞增殖能力檢測使用EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）細(xì)胞增殖試劑盒，實(shí)驗(yàn)前 1d細(xì)胞按2×104cell／well鋪96孔板，設(shè)ADAM8對照組、過表達(dá)組和干擾組，每組2個(gè)復(fù)孔，分別轉(zhuǎn)染后于37℃，飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出96孔板，以1∶1000濃度進(jìn)行EdU標(biāo)記孵育2 h。細(xì)胞固定30min后依照說明書進(jìn)行Apollo染色和DNA染色。熒光顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。MTS法用于細(xì)胞活性檢測，實(shí)驗(yàn)前1天細(xì)胞按1×104cell／well鋪96孔板，設(shè)ADAM8對照組、過表達(dá)組和干擾組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染后分別于0 h、24 h、48 h、72 h和 96 h取出 96孔板，加入 20 uL／well MTS溶液（單溶液細(xì)胞增殖檢測試劑盒），37℃孵育1.5 h，在酶標(biāo)儀上49 nm處讀取OD值（A490）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以時(shí)間和OD值繪制增值曲線。

1.6 PIP3K酶活檢測 取出各組3個(gè)孔的細(xì)胞，0.05%胰酶消化細(xì)胞，PBS洗脫，900 r／min離心5min，去上清，收集細(xì)胞。使用 1×RIPA lysis Buffer（50mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl，1%Nonidet P-40，0.5%deoxycholic acid，0.1%sodium dodecyl sulfate（SDS），5mM EDTA，2mM phenylmethylsulfonyl fluoride（PMSF），20 g／mL aprotinin，20 g／mL leupeptin，10 g／mL pepstanin A，150 mM benzamidine）提取細(xì)胞總蛋白，并用BCA法測定總蛋白的濃度，然后按照PI3-Kinase Activity AlphaScreen?Assay Kit說明書檢測單位量的總蛋白中PI3K的活性。

1.7 Western Blot 用Western Blot檢測細(xì)胞中ADAM8、Akt、Ser473 phospho-Akt和mTOR蛋白的表達(dá)。取相同數(shù)目的細(xì)胞，900 r／min離心5min，1×RIPA lysis Buffer重懸，冰上裂解30min。再經(jīng)12000 r／min離心10min，收集上清液。用BCA方法定量蛋白濃度，并且按照每泳道10 ug的蛋白上樣量進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳（室溫下80 V×20min，120 V×60min）結(jié)束后，轉(zhuǎn)至PVDF膜（25 V／0.3A×45min，恒流），5%牛奶室溫封閉1 h，一抗冰上孵育過夜，PBST清洗后使用IRDyes熒光共軛二抗標(biāo)記的一抗，室溫孵育1 h，在奧德賽紅外成像系統(tǒng)上顯影并分析各種蛋白相對于GAPDH的表達(dá)量。一抗mouse monoclonal anti-ADAM8 antibody（1∶250稀釋），rabbit anti-p-Akt（1∶1 000稀釋），Akt（pan）（40D4）MousemAb（1∶1 000稀釋），mTOR（7C10）RabbitmAb（1∶1 000稀釋），mouse anti-GAPDH（1∶10 000稀釋）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)計(jì)量資料用“±s”表示，組間比較采用配對t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADAM8過表達(dá)和干擾表達(dá)載體的構(gòu)建 轉(zhuǎn)染ADAM8過表達(dá)載體和干擾表達(dá)載體后檢測HCT8細(xì)胞ADAM8表達(dá)量，由圖1可知，過表達(dá)組ADAM8表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.05），而干擾組ADAM8的表達(dá)量顯著低于對照組（P＜0.05），說明過表達(dá)載體和干擾表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 轉(zhuǎn)染ADAM8過表達(dá)和干擾表達(dá)載體后ADAM8表達(dá)情況a.Western Blot結(jié)果；b.蛋白表達(dá)輝度比例結(jié)果*P＜0.05，與對照組相比Fig.1 ADAM8 expression after transfected with ADAM8 overexpressionplasmid and RNA interference plasmida.Western Blot results；b.Protein luminance ratio results*P＜0.05，compared with control group

2.2 ADAM8過表達(dá)和干擾表達(dá)對細(xì)胞增殖的影響 采用EdU5-Ethynyl-2’-deoxyuridine方法檢測ADAM8過表達(dá)和干擾后的細(xì)胞增殖情況見圖2a，2b。從圖中可以看出，過表達(dá)組細(xì)胞DNA復(fù)制活性（1.22±0.13）顯著高于對照組（1.00±0.12，P＜0.05），干擾組細(xì)胞DNA復(fù)制活性（0.78±0.11）顯著低于對照組（1.00±0.12，P＜0.05）。說明當(dāng)ADAM8被干擾表達(dá)后細(xì)胞增殖能力下降，同時(shí)當(dāng)ADAM8表達(dá)量上升后細(xì)胞增殖能力加強(qiáng)。采用MTS實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活性，結(jié)果見圖2c，結(jié)果同樣說明干擾組細(xì)胞活性下降，而過表達(dá)組細(xì)胞活性增強(qiáng)。與EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

圖2 轉(zhuǎn)染ADAM8過表達(dá)和干擾表達(dá)載體后細(xì)胞增殖情況a，b.EdU檢測細(xì)胞增值活性；c.MTS檢測細(xì)胞增值活性*P＜0.05，與對照組相比Fig.2 Situation of HCT8 cell proliferation after transfected with ADAM8 overexpression plasmid and RNA interference plasmida，b.Cell proliferation activity detected by EdU；c.Cell proliferation activity detected by MTS*P＜0.05，compared with control group

2.3 ADAM8過表達(dá)和干擾表達(dá)對PI3K-Akt-mTOR的影響為了驗(yàn)證過表達(dá)ADAM8和干擾表達(dá)ADAM8對細(xì)胞增殖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，本文對3組的PI3K酶活、p-Akt和Akt的相對量以及mTOR表達(dá)量進(jìn)行了檢測，結(jié)果見圖3、4和5。從圖3可看出，ADAM8過表達(dá)和干擾表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)PI3K的酶活性均未改變，說明ADAM8表達(dá)不會影響PI3K的酶活。圖4可看出，ADAM8過表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)p-Akt表達(dá)量增加，被干擾表達(dá)后p-Akt表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。圖5可看出，ADAM8過表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)mTOR表達(dá)量增加，被干擾表達(dá)后mTOR表達(dá)量降低。

圖3 轉(zhuǎn)染ADAM8過表達(dá)和干擾表達(dá)載體后HCT8細(xì)胞內(nèi)PI3K酶活性變化情況Fig.3 PI3K activity in HCT8 cell after transfected with ADAM8 overexpression plasmid and RNA interference plasmid

圖4 轉(zhuǎn)染ADAM8過表達(dá)和干擾表達(dá)載體后HCT8細(xì)胞內(nèi)p-Akt相對于Akt表達(dá)量a.Western Blot結(jié)果；b.蛋白表達(dá)輝度比例結(jié)果*P＜0.05，與對照組相比Fig.4 The ratio of p-Akt to Akt in HCT8 cell after transfected with ADAM8 overexpression plasmid and RNA interference plasmida.Western Blot results；b.Protein luminance ratio results*P＜0.05，Compared with control group

圖5 轉(zhuǎn)染ADAM8過表達(dá)和干擾表達(dá)載體后HCT8細(xì)胞內(nèi)mTOR相對表達(dá)量a.Western Blot結(jié)果；b.蛋白表達(dá)輝度比例結(jié)果*P＜0.05，與對照組相比Fig.5 RelativemTOR expression in HCT8 cell after transfected with ADAM8 overexpression plasmid and RNA interference plasmida.Western Blot results；b.Protein luminance ratio results*P＜0.05，compared with control group

3 討論

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)揮的過表達(dá)作用可顯著提高ADAM8的過表達(dá)效率，該技術(shù)作為新一代高效表達(dá)載體大大促進(jìn)了腫瘤基因的基礎(chǔ)研究。ADAM8在多數(shù)惡性腫瘤組織中豐富表達(dá)［5-7］，在結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于癌旁組織。但ADAM8在結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT8細(xì)胞中表達(dá)相對較低（數(shù)據(jù)未發(fā)表），本文通過轉(zhuǎn)染ADAM8過表達(dá)質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒，比較過表達(dá)和抑制表達(dá)后細(xì)胞增殖情況，以及PI3K-Akt-mTOR細(xì)胞增殖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中信號分子的表達(dá)變化。從結(jié)果可知，ADAM8過表達(dá)后細(xì)胞增殖增強(qiáng)，被干擾后細(xì)胞增殖減弱?？梢夾DAM8參與調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞HCT8的增殖，可能是作為一種抑制癌細(xì)胞增殖的靶點(diǎn)分子。為進(jìn)一步明確ADAM8參與HCT8細(xì)胞增殖的機(jī)制，對增殖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑PI3K-Akt-mTOR中的信號分子進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADAM8的表達(dá)變化不會影響細(xì)胞中PI3K的酶活，但過表達(dá)ADAM8會增強(qiáng)下游Akt的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)mTOR的表達(dá)。當(dāng)ADAM8被抑制后情況正好相反。由此可見，ADAM8可通過增強(qiáng)Akt的磷酸化促進(jìn)mTOR的表達(dá)，發(fā)揮對HCT8細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用。

與結(jié)腸癌發(fā)生相關(guān)的蛋白因子很多，如 CEA［8］、EGF［9］、Urotensin-II receptor［10］、CSF［11］等。Zhang Y等［12］在肝癌患者病灶組織中發(fā)現(xiàn)ADAM8過表達(dá)，且調(diào)查發(fā)現(xiàn)54.3%的肝癌患者病灶組織中ADAM8過表達(dá)，與Jiang C等［13］研究一致。Zhang W等［14］通過體外培養(yǎng)非小細(xì)胞癌細(xì)胞株，經(jīng)ADAM8干擾后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對化藥敏感性增強(qiáng)，且證實(shí)是通過STAT3信號途徑發(fā)揮作用，進(jìn)一步明確了ADAM8與癌癥的相關(guān)性。有關(guān)ADAM8與結(jié)腸癌的相關(guān)性研究未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)ADAM8，能促進(jìn)HCT8細(xì)胞的增殖，抑制表達(dá)后細(xì)胞增殖變緩，證實(shí)ADAM8基因參與了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。

PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是作為細(xì)胞增殖的主要調(diào)控信號通路［15-16］。本文也探討了過表達(dá)和干擾表達(dá)ADAM8后細(xì)胞中上述信號分子的表達(dá)變化。PI3K作為一類生長因子受體效應(yīng)分子，當(dāng)生長因子受體與配體結(jié)合后會被激活。本文結(jié)果顯示無論ADAM8過表達(dá)還是抑制表達(dá)，PI3K的活性均未改變，說明ADAM8不參與PI3K活化，可能在胞內(nèi)發(fā)揮作用，或通過其他受體發(fā)揮影響細(xì)胞增殖的作用。值得注意的是，雖然PI3K無變化，但過表達(dá)ADAM8后，下游Akt的磷酸化水平顯著增強(qiáng)，且mTOR表達(dá)量隨之升高。抑制表達(dá)后作用相反。因此可以肯定的是，ADAM8是通過活化 PI3K-Akt-mTOR信號通路中 AktmTOR通路來發(fā)揮影響細(xì)胞增殖的作用。

本文初步探討了ADAM8參與結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖過程及相關(guān)機(jī)制，但ADAM8在實(shí)體瘤中的致癌作用及在相關(guān)腫瘤信號途徑中的調(diào)控作用仍不明確，ADAM8對大腸癌中癌基因及抑癌基因的影響以及ADAM8在大腸癌細(xì)胞生長及耐藥中的機(jī)制需要進(jìn)一步探索。此外ADAM8對結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，包括遷移和侵襲等方面的作用和相關(guān)機(jī)制也將作為重要考察方向。這些都有待進(jìn)一步研究。

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（編校：吳茜）

ADAM 8 gene promotes proliferation of colon cancer cell HCT8 through AKT／m TOR signaling pathway

BAIYang，CHEN Hao，LIJi-zheng，HUANG Jin-tuan，YANG Zu-liΔ

（Department of Gastrointestinal Surgery，The Sixth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510655，China）

ObjectiveTo investigate the effectofa disintegrin and metalloprotease domain（ADAM8）gene on colon cancer HCT8 cell proliferation and proliferation signal transduction pathways PI3K-Akt-mTOR.MethodsColon cancer HCT8 cellswere cultured in vitro，and transfected with ADAM8 overexpression plasmid and RNA interfering plasmid.Cell proliferation were detected by EdU and MTSmethod assays.PI3K activity wasmeasured by PI3K activity detection kit，Western Blotmethod was performed to detect the ratio of Akt and p-Akt and expression ofmTOR.ResultsCompared with control group（1.00±0.12），the cell proliferation in ADAM8 overexpression group（1.22±0.13）was significantly higher（P＜0.05）and in RNA interfering group（0.78±0.11）was significantly lowerwhile PI3K activity had no significant changes in three groups.After ADAM8 overexpression，and the ratio of p-Akt／Akt and mTOR expression were increased significantly，while reduced significantly after RNA interferered.ConclusionADAM8 can promote HCT8 cell proliferation through enhancing the phosphorylation of Akt and promoting the expression ofmTOR.

a disintegrin and metalloprotease domain 8；colon carcinoma；immunoblotting；interference expression

R 735.34

A

1005－1678（2014）03－0024－04

結(jié)腸癌是腸道部位發(fā)生的惡性腫瘤，主要以腺癌為主。結(jié)腸癌上皮細(xì)胞的癌化、浸潤和轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌發(fā)生和惡化的特征［1］。在這個(gè)過程中，細(xì)胞增殖是影響結(jié)腸癌進(jìn)展的主要因素。PI3K-Akt是細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡中重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其中配體與受體的結(jié)合導(dǎo)致PI3K被激活，使PIP2磷酸化生成PIP3，然后導(dǎo)致Akt磷酸化，促進(jìn)mTOR表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖［2］。解整合素樣金屬蛋白酶 8（adisintegrin and metalloprotease domain 8，ADAM8）是由 ADAM8基因編碼的蛋白，主要參與細(xì)胞與細(xì)胞間，細(xì)胞與基質(zhì)之間相互作用，其在細(xì)胞黏附中發(fā)揮重要的作用［3］，與癌癥細(xì)胞增殖相關(guān)［4］。近年來，國內(nèi)外研究顯示，ADAM8在不同腫瘤中的表達(dá)以及功能是不同的。臨床研究發(fā)現(xiàn)ADAM8與肺癌［5］、乳腺腺［6］和前列腺癌［7］的發(fā)生和發(fā)展存在相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者病灶組織 ADAM8表達(dá)量會增加（數(shù)據(jù)未發(fā)表），因此猜測ADAM8的過表達(dá)可能與結(jié)腸癌相關(guān)。為了驗(yàn)證這一猜想，本文通過體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT8細(xì)胞，構(gòu)建ADAM8過表達(dá)和干擾質(zhì)粒載體，旨在觀察ADAM8過表達(dá)和低表達(dá)后對細(xì)胞增殖及增殖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑PI3K-Akt-mTOR的影響。

白楊，男，碩士，研究方向：ADAM8基因的表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及其他方面的影響，E-mail：Rexby1986＠163.com；楊祖立，通信作者，男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：胃腸腫瘤研究，E-mail：yzlhlj7068＠163.com。