榮 輝，林祥志，王龍梅，蘇永全

(1. 廈門大學(xué) 海洋與地球?qū)W院，福建 廈門 361005； 2. 國家海洋局第三海洋研究所，福建 廈門 361005)

二十碳五烯酸(eicxcosapentanoic acid，EPA) 屬于ω-3系列多不飽合脂肪酸，它是大腦和視神經(jīng)細胞的重要組成部分，由于極易被氧化形成保護膜，可以延緩腦、眼神經(jīng)細胞的衰老[1].EPA在人體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為前列腺素E3和前列環(huán)素，具有抑制血小板聚集、擴張血管、加強微循環(huán)作用，因此它對心血管疾病的治療與預(yù)防也具有重大意義[2-3].許多微藻都有較高的EPA 含量[3]，如硅藻(Nitzschialaevis)[4]、微小小球藻(Chlorellaminutissima)[5]、紫球藻(Porphyridiumcruentum)[6]、三角褐指藻(Phaeodactylumtricomutum)[7]、球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)[8]、眼點擬微綠球藻(Nannochloropsisoculata)[9]和單胞藻 (Monodussubterraneus)[10]等都被認為是商業(yè)化生產(chǎn)EPA的潛在重要資源.

高速逆流色譜(high-speed countercurrent chromatography，HSCCC)是由美國國立衛(wèi)生研究院的Ito博士于20世紀80年代發(fā)明的一種基于液液分配機理的新型色譜分離純化技術(shù)，它的固定相和流動相都是液體，沒有不可逆吸附，具有樣品無損失、無污染、高效、快速和大制備量分離等優(yōu)點[11].本研究主要是利用高速逆流色譜技術(shù)分離純化微小小球藻中的EPA，為其進一步開發(fā)利用提供技術(shù)支持.

1 材料和方法

1.1 實驗材料、試劑及儀器

微小小球藻：購自美國德克薩斯州立大學(xué)藻種庫，編號為UTEX 2341.

正庚烷、乙腈、乙酸、甲醇、乙醚、硫酸等均為分析純，EPA標準品為色譜純(Sigma)，液相色譜檢測用試劑均為色譜純.

高速逆流色譜儀(上海同田生物技術(shù)有限公司，TBE-300B)；蒸發(fā)光散射檢測器(上海通微分析技術(shù)有限公司，ELSD-UM5000)；高效液相色譜儀(日本島津制作所，LC-20A)；脂肪測定儀(上海新家儀器有限公司，SZF-06A)；發(fā)酵罐(匯和堂生物工程設(shè)計(上海)有限公司，SY-3000E).

1.2 微小小球藻的發(fā)酵培養(yǎng)及收集

培養(yǎng)基(1 L)：改良的UTEX Bristol Medium (含葡糖糖10 g/L).

發(fā)酵培養(yǎng)條件：溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速250 r/min，培養(yǎng)時間96 h，pH值6.8.

將發(fā)酵液在離心力18 000 g，溫度4 ℃下離心15 min，收集沉淀，再經(jīng)真空低溫冷凍干燥得到微小小球藻藻粉.

1.3 微藻油的提取及皂化處理

采用傳統(tǒng)的氯仿-甲醇法[12]從5.0 g微小小球藻藻粉中提取油脂.

稱量500 mg微藻油，加入25 mL濃度為0.5 mol/L 的氫氧化鉀溶液在70 ℃水浴下處理1.5 h后，再用硫酸水溶液(體積分數(shù)為20%)調(diào)pH值至3，得到酸性混合液；然后用等體積的乙醚萃取酸性混合液3次，收集乙醚相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醚，用100 mL溶劑體系為正庚烷-乙腈-乙酸-甲醇的下相溶解，得到皂化處理后溶液.

1.4 HSCCC溶劑體系的選擇和HSCCC分離

根據(jù)EPA在不同兩相溶劑體系的分配系數(shù)K值來選擇合適的溶劑體系，K值為EPA在溶劑體系上相與下相峰面積的比值.待測溶劑體系為不同體積比(5∶3∶5∶1，5∶4∶5∶1，5∶4∶3∶1，5∶4∶1∶1，5∶5∶1∶1)下的乙腈-正庚烷-乙酸-甲醇溶液.

將皂化處理后溶液進行HSCCC分離，所用溶劑體系為乙腈-正庚烷-乙酸-甲醇，下相為流動相，上相為固定相，在一定的轉(zhuǎn)速，溶劑流速、溫度下進行分離，進樣量為20 mL，檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器：漂移管溫度70 ℃，氣體流量為2.5 L/min.

1.5 HSCCC分離條件的響應(yīng)面分析

根據(jù)Box-Benhnken 的中心組合實驗設(shè)計原理，采用響應(yīng)面法在三因子三水平上對微小小球藻油脂中EPA的高速逆流色譜提取條件進行優(yōu)化.實驗因子和水平如表1.共進行17 組實驗，以EPA的純度Y為響應(yīng)值，實驗數(shù)據(jù)利用軟件Design-Expert 8.0.6.1進行分析.

表1 實驗因子和水平

1.6 HPLC檢測分析

分離獲得的EPA樣品用甲醇溶解后進行HPLC分析，色譜柱為inertsil ODS-3(5 μm×50 mm×4.6 mm)，柱溫35 ℃，流動相為甲醇：2%的乙酸水溶液(95∶5，V/V)，流速為1 mL/min，進樣量為10 μL.檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器：漂移管溫度70 ℃，氣體流量為2.5 L/min.

2 結(jié)果與分析

2.1 藻細胞的收集及油脂提取

通過發(fā)酵罐對微小小球藻進行高密度異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)96 h后，發(fā)酵液經(jīng)離心濃縮后收集藻細胞，再經(jīng)真空冷凍干燥后稱重，生物量達到10 g/L(以細胞干重計).5.0 g藻粉經(jīng)氯仿-甲醇法粗提獲得0.5 g的粗油脂，含油率為10%.

2.2 HSCCC溶劑體系的選擇

由于EPA是親脂性的，根據(jù)曹學(xué)麗的相關(guān)報道[13]，選取乙腈-正庚烷-乙酸-甲醇為兩相溶劑體系，EPA在其不同體積比下的K值經(jīng)檢測結(jié)果見表2.根據(jù)報道，適合逆流色譜分離的K值范圍為0.5-2.0[14]，當(dāng)乙腈-正庚烷-乙酸-甲醇在體積比為5∶4∶1∶1時，其K值為0.55，因此選擇其為合適的溶劑體系進行接下來的實驗.

表2 EPA在不同體積比溶劑體系下的K值

2.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)Box-Benhnken中心實驗設(shè)計，共進行17 組實驗，其中12 組為分析因子，5 組為零點，實驗結(jié)果見表3.利用Design-Expert軟件對實驗結(jié)果進行回歸分析，得到二次多元回歸模型，通過最小二乘法擬合二次多元方程為：

Y= -514.73-0.26X1+ 112.89X2+0.97X3-0.03X12-22.71X22-6.28 × 10-4X32- 0.31X1X2+ 2.87 × 10-3X1X3+ 0.04X2X3．

表3 Box-Behnken 中心實驗設(shè)計及結(jié)果

表4 實驗結(jié)果ANOVA分析及模型的方差分析表

一般來說HSCCC轉(zhuǎn)速越高，流動相流速越低，分離溫度越高，固定相的保留率越高，分離效果就越好，但是高轉(zhuǎn)速對儀器產(chǎn)生較大的磨損、耗能多，低流速雖然可以滿足高固定相保留率的要求，但是洗脫時間太長，且耗費大量的流動相，而溫度太高則會造成溶液的黏度降低進而影響分離效果[14].

由圖1可看出：EPA純度響應(yīng)面和等高線分析情況.圖1(a)顯示在HSCCC轉(zhuǎn)速固定為900 r/min時，流動相流速和分離溫度對EPA純度影響的交互作用，隨著流動相流速和分離溫度的增加，EPA純度先增加后降低.圖1(b)顯示在流動相流速固定為3.0 mL/min時，HSCCC轉(zhuǎn)速和分離溫度對EPA純度影響的交互作用，隨著HSCCC轉(zhuǎn)速和分離溫度的增加，EPA純度先增加后降低.圖1(c)顯示在分離溫度固定為25 ℃時，HSCCC轉(zhuǎn)速和流動相流速對EPA純度影響的交互作用，隨著HSCCC轉(zhuǎn)速和流動相流速的增加，EPA純度先增加后降低.

(a) 流動相流速和溫度對EPA純度影響的交互作用；(b) HSCCC轉(zhuǎn)速和分離溫度對EPA純度交互作用；(c) HSCCC轉(zhuǎn)速和流動相流速對EPA純度影響的交互作用

最終根據(jù)模型分析，HSCCC分離純化EPA的優(yōu)化條件為：轉(zhuǎn)速912.78 r/min，溶劑流速3.12 mL/min，溫度20.93 ℃，在此條件下EPA純度Y預(yù)測值為99.40%.

2.4 HSCCC分離

將皂化處理后微小小球藻油脂樣品在優(yōu)化條件下進行HSCCC分離，實際實驗采用：轉(zhuǎn)速913 r/min，溶劑流速3.0 mL/min，溫度21 ℃.HSCCC分離色譜圖如圖2所示，通過與標準品比對，EPA的出峰時間約為24 min，收集EPA組分，旋蒸除去有機溶劑，待進行HPLC檢測分析.由于皂化過程中大多脂肪酸以外的油脂組分被除去，最終500 mg微小小球藻粗油脂中分離純化得到75 mg EPA.

t/min

2.5 HPLC檢測分析

將分離獲得的EPA樣品用甲醇溶解后進行HPLC分析，結(jié)果如圖3所示，利用面積歸一法計算EPA純度高達99.44%.

t/min

3 討 論

3.1 EPA來源

本研究選取了微小小球藻作為EPA的生產(chǎn)來源，據(jù)報道其細胞脂肪酸組成簡單，EPA占總脂肪酸含量可高達44.7%[5]，本研究通過HSCCC分離純化獲得的EPA僅占所提油脂含量的15%，主要是因為油脂在皂化過程中除去了其它脂類，剩下的脂肪酸的含量變少.

3.2 EPA的HSCCC分離

隨著對海洋生物脂肪酸研究的深入以及各種層析、色譜技術(shù)的出現(xiàn)，人們研究了眾多從生物體中提取多不飽和脂肪酸的方法，主要有：溶劑萃取法、低溫結(jié)晶法、尿素包合法、吸附分離法、分子蒸餾法、脂肪酶濃縮法、超臨界CO2提取法、高效液相色譜法、金屬鹽形成法等[15].HSCCC與傳統(tǒng)的分離純化方法相比具有明顯的優(yōu)點，但凡可以形成萃取分離體系的對象原則上都可以用逆流色譜進行分離.本研究將高速逆流色譜技術(shù)引用到微小小球藻油脂中EPA的制備分離上，而利用高速逆流色譜技術(shù)分離化合物成功的關(guān)鍵在于兩相溶劑體系的選擇.因為EPA是親脂類的多不飽和脂肪酸，本研究選用的溶劑體系為正庚烷-乙腈-乙酸-甲醇，并且比較了EPA在不同體積比下的K值，最終確定合適的溶劑體系為乙腈-正庚烷-乙酸-甲醇(體積比為5∶4∶1∶1)，并利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了HSCCC分離純化EPA的條件，在此優(yōu)化條件下分離獲得的EPA純度達到99.44%.

3.3 EPA的檢測分析

由于EPA無紫外吸收，而氣相色譜檢測需要甲酯化處理，且無法和高速逆流色譜儀的直接連接實現(xiàn)在線分析，因此本研究使用了蒸發(fā)光散射檢測器對EPA進行檢測分析，它不僅可以直接和高速逆流色譜儀在線連接，且可以對分離的樣品通過分流閥直接進入蒸發(fā)光散射檢測器進行在線檢測，無需衍生.蒸發(fā)光散射檢測器還可以直接和液相色譜相連，對接收到的經(jīng)高速逆流色譜分離的EPA組分進行液相色譜純度分析.

4 結(jié) 語

本研究首次將高速逆流色譜技術(shù)應(yīng)用到微小小球藻油脂中EPA的分離純化上，經(jīng)篩選合適的兩相溶劑體系為乙腈-正庚烷-乙酸-甲醇(體積比為5∶4∶1∶1).并利用響應(yīng)面分析法對高速逆流色譜實驗中的關(guān)鍵參數(shù)進行了優(yōu)化設(shè)計，得到的最佳條件為：流速3.0 mL/min，轉(zhuǎn)速913 r/min，分離溫度21 ℃，在此條件下，500 mg微小小球藻粗油脂中分離純化到純度為99.44%的75 mg EPA.本研究說明游離多不飽和脂肪酸可以通過高速逆流色譜技術(shù)得到較好的分離純化，為其進一步開發(fā)利用提供技術(shù)支持.

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