段瑩瑩，田彩芳，宋宇琴，李六林

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801)

雪花梨的離體培養(yǎng)與快速繁殖

段瑩瑩，田彩芳，宋宇琴，李六林

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801)

以雪花梨的單芽莖段為外植體，建立了雪花梨離體培養(yǎng)和快速繁殖體系。試驗(yàn)表明，5月中旬為雪花梨取材的最佳時(shí)間；基本培養(yǎng)基、6-BA和NAA等3種因素對(duì)黃冠芽增殖影響差異較大，按影響大小依次為6-BA、基本培養(yǎng)基、NAA；最佳的雪花梨組培苗增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.15 mg·L-1+GA30.5 mg·L-1，增殖系數(shù)達(dá)3.9；適宜雪花梨組培苗的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 1.0 mg·L-1，生根率達(dá)41.4%。

雪花梨；單芽莖段；生根；離體培養(yǎng)；快速繁殖

雪花梨(PyrusbretschneideriRehd.)屬白梨系統(tǒng)，是華北地區(qū)主栽的大果型傳統(tǒng)品種，以其品質(zhì)優(yōu)良和獨(dú)特風(fēng)味倍受國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的青睞[1]。雪花梨適應(yīng)區(qū)域廣，不僅適宜北方大部分地區(qū)栽培，而且適于長(zhǎng)江流域及其以南多數(shù)地區(qū)栽培。但雪花梨在生產(chǎn)中表現(xiàn)出果實(shí)石細(xì)胞較多、易感黑星病等問(wèn)題，嚴(yán)重影響著雪花梨的品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由于梨樹(shù)生物學(xué)特性的限制，用常規(guī)育種手段改良梨品種的周期長(zhǎng)、效率低，現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展為梨育種提供了新方法[2]。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，可通過(guò)引入外源目的基因定向地改變植株的不良性狀[3]。

為此本試驗(yàn)以雪花梨為試材，對(duì)影響雪花梨離體培養(yǎng)的因素進(jìn)行了研究，以期建立雪花梨的高效離體繁殖體系，為梨的快速繁殖、脫毒及基因轉(zhuǎn)化提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于山西省農(nóng)科院果樹(shù)研究所梨樹(shù)資源圃選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的雪花梨樹(shù)體，采集當(dāng)年生幼嫩枝條，去葉片帶回備用。

1.2 試驗(yàn)內(nèi)容與方法

1.2.1 初代培養(yǎng)

取樣時(shí)間為2012年5月1日，5月20日，6月10日和6月30日。流水沖洗材料2 h。剪取3 cm帶單芽莖段，在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行消毒。先用75%酒精消毒30 s，無(wú)菌水沖洗3次。再用0.1% HgCl2消毒4 min(加2滴吐溫)，無(wú)菌水漂洗5次。然后將其接入新鮮的初代培養(yǎng)基MS+6-BA1.0 mg·L-1+IBA0.1 mg·L-1，附加蔗糖30g·L-1，瓊脂6 g·L-1，pH 5.8，放在培養(yǎng)室中(培養(yǎng)室溫度為25±2℃，光周期(光照/黑暗)16 h/8 h，光強(qiáng)為2000 Lx),培養(yǎng)。每個(gè)處理30個(gè)莖段，重復(fù)3次，接種30天后統(tǒng)計(jì)褐化率、污染率及萌發(fā)率。

1.2.2 增殖培養(yǎng)

取初代培養(yǎng)獲得的雪花梨的試管苗接入增殖培養(yǎng)基中，觀察芽苗的生長(zhǎng)情況。增殖培養(yǎng)基采用3因素3水平正交設(shè)計(jì)，以基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA為試驗(yàn)因素，共9個(gè)處理(表1)，每個(gè)處理附加0.5 mg·L-1GA3。每個(gè)處理30個(gè)莖段，重復(fù)3次，繼代40天后統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)。增殖倍數(shù)=gt;0.5 cm的莖段總數(shù)/接種時(shí)總莖數(shù)。

表1 增殖培養(yǎng)基正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(33)

1.2.3 生根培養(yǎng)

將2～3 cm長(zhǎng)勢(shì)較好的試管苗接種到1/2MS+IBA(0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1)的生根培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)1周后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)，35 d后觀察生根情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，SAS8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Origin6繪制三維圖形。

2 結(jié)果分析

2.1 取材時(shí)間對(duì)雪花梨初代培養(yǎng)的影響

由圖1可見(jiàn)，雪花梨5月20日的存活率最高達(dá)到56.67%，5月1日污染率最低(12.22%)，6月30日褐化率最低(21.11%)。5月20日的存活率與6月10日(54.44%)之間差異不顯著，顯著高于5月1日(37.78%)和6月30日(33.33%)。6月30日的褐化率與6月10日(22.22%)和5月20的(22.22%)差異不顯著，極顯著低于5月1日(50.00%)。5月1日的污染率與5月20日(21.11%)的差異不顯著，極顯著低于6月10日(23.33%)和6月30 日(45.56%)的。綜合考慮認(rèn)為5月中旬是雪花梨采集外植體的最佳時(shí)間。

圖1 取材時(shí)間對(duì)雪花梨初代培養(yǎng)的影響

2.2 不同因素對(duì)雪花梨單芽莖段增殖的影響

從表2可見(jiàn)，3種因素對(duì)雪花梨組培苗增殖影響差異較大，按影響大小依次為6-BA、基本培養(yǎng)基、NAA。由表2的K值得出最佳培養(yǎng)基為A1B2C2，即MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.15 mg·L-1+GA30.5 mg·L-1，以此培養(yǎng)基作為雪花梨組培苗的增殖培養(yǎng)基，增殖系數(shù)達(dá)3.9。

表2 雪花梨增殖培養(yǎng)正交試驗(yàn)結(jié)果

基本培養(yǎng)基MS對(duì)雪花梨增殖影響最大，與其它2種培養(yǎng)基的增殖系數(shù)差異顯著。6-BA 1.0 mg·L-1和2.0 mg·L-1對(duì)雪花梨增殖影響最大，1.0 mg·L-16-BA的增殖倍數(shù)與2.0 mg·L-16-BA相比差異不顯著，與0.5 mg·L-16-BA的增殖系數(shù)差異極顯著。NAA0.15 mg·L-1和0.2 mg·L-1對(duì)雪花梨增殖影響最大，0.15 mg·L-1NAA的增殖倍數(shù)與0.2 mg·L-1NAA的差異不顯著，與0.1 mg·L-1NAA的差異顯著。綜合考慮，對(duì)增殖系數(shù)要求不高時(shí)可將最佳培養(yǎng)基的NAA含量降到0.1 mg·L-1，降低成本。

2.3 MS培養(yǎng)基中6-BA與NAA對(duì)增殖系數(shù)的影響

由圖2可看出，在MS培養(yǎng)基中，隨著6-BA和NAA濃度的升高，雪花梨單芽莖段的增殖系數(shù)整體呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)6-BA濃度為0.2～0.8 mg·L-1時(shí)，隨著NAA濃度的增加，增殖系數(shù)先增加后趨于穩(wěn)定；當(dāng)6-BA濃度為0.8～1.0 mg·L-1時(shí)，隨著NAA濃度的增加，增殖系數(shù)先急劇上升到達(dá)峰值(3.9)后降低；當(dāng)6-BA濃度為1.0～2.0 mg·L-1時(shí)，隨著NAA濃度的增加，增殖系數(shù)呈緩慢上升。由此可得出，0.8～1.0 mg·L-16-BA和0.1～0.12 mg·L-1NAA是雪花梨增殖的最佳條件。當(dāng)試驗(yàn)對(duì)組培苗增殖要求不是很高時(shí)，可以調(diào)整6-BA濃度到0.2～0.8 mg·L-1，既節(jié)約成本還能避免因長(zhǎng)期使用較高濃度細(xì)胞分裂素引起的玻璃化。

圖2 MS培養(yǎng)基中6-BA與NAA對(duì)增殖系數(shù)的影響

2.4 不同濃度IBA對(duì)組培苗生根的影響

由表3可見(jiàn)，當(dāng)IBA濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，生根率達(dá)41.4%，生根較快，根系生長(zhǎng)正常，根較多，分別是0.5、1.5、2.0 mg·L-1IBA的2.5、1.8、2.2倍。因此1/2MS+IBA 1.0 mg·L-1為雪花梨組培苗生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。

表3 不同濃度IBA對(duì)組培苗生根的影響

3 討論

在雪花梨單芽莖段初培階段，采集外植體的時(shí)間不同，其污染率和褐化率存在著很大的差異，這與張玉嬌[4]對(duì)黃冠梨組培快繁的研究結(jié)果相一致。污染是組織培養(yǎng)過(guò)程中的難題，按其來(lái)源可分為3大類：材料帶菌、接種污染和培養(yǎng)過(guò)程污染。初代培養(yǎng)過(guò)程中的污染主要是外植體本身帶菌或其表面殺菌不徹底造成的?？蓪?duì)采集樹(shù)體或外植體做一些預(yù)處理和多不同的外植體采取不同的消毒方式來(lái)降低污染。Rugge BA[5]等在采集外植體前用敵菌丹殺菌劑處理田間的披散山龍眼母樹(shù), 使污染從對(duì)照的90%減少至14%。Langens[6]等將美麗百合的鱗莖外植體放入試管中進(jìn)行43℃熱擊處理，有效的減少了污染。褐化也是影響初代培養(yǎng)效率的主要因素之一，本試驗(yàn)繼代過(guò)程中發(fā)現(xiàn)雪花梨組培苗極易褐化，大大影響了組培效率。合適的取材時(shí)間、對(duì)外植體進(jìn)行預(yù)處理[7,8]、適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件、加抗氧化劑如Vc、活性炭[9]、抗壞血酸[10]、PVP[11]等和連續(xù)轉(zhuǎn)移[12]可有效地防止褐化。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明基本培養(yǎng)基種類和附加激素6-BA、NAA均能影響黃冠單芽莖段的增殖，且基本培養(yǎng)基的影響最大。在MS基本培養(yǎng)基上，雪花梨組培苗葉片顏色濃綠，這與張俊林等對(duì)核桃的研究結(jié)果相一致[13]。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是芽增殖培養(yǎng)基中必不可少的，本試驗(yàn)結(jié)果表明6-BA對(duì)增殖系數(shù)的影響比NAA大，但是6-BA濃度并不是越大越好，0.8～1.0 mg·L-16-BA對(duì)雪花梨組培苗的增殖影響最大。張鋒[14]研究表明6-BA濃度過(guò)低，對(duì)組培苗生長(zhǎng)的促進(jìn)作用較小，濃度過(guò)高，雖然能提高分化系數(shù)，但會(huì)導(dǎo)致玻璃化率過(guò)高，不利于組培苗的生長(zhǎng)。0.1～0.12 mg·L-1NAA對(duì)雪花梨的增殖影響最大，這與金青[15]等對(duì)碭山酥梨的研究結(jié)果相一致。GA3能促進(jìn)莖的伸長(zhǎng)[16]，添加適當(dāng)?shù)腉A3，能提高組培苗的增殖系數(shù)。

4 結(jié)論

于5月中下旬采集生長(zhǎng)健壯的雪花梨單芽莖段接種在MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1培養(yǎng)基上進(jìn)行初代培養(yǎng)，其存活率最高。30天后轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.15 mg·L-1+GA30.5 mg·L-1上其增殖系數(shù)最大，達(dá)3.9。組培苗在生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA 1.0 mg·L-1上生根率最大，達(dá)41.4%，成功建立了雪花梨快速繁殖體系。

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InvitroCultureandRapidPropagationofPearXuehuali

Duan Yingying, Tian Caifang, Song Yuqin, Li Liulin

(CollegeofHorticulture,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China)

Single bud stem of Pear Xuehuali were used as explants to establishinvitroculture and rapid propagation system. The results showed that mid-May was the best sampling time for Xuehuali, effect of culture medium, 6-BA and NAA on proliferation coefficient showed great difference, their impacts followed a descending order of 6-BA, culture medium, NAA; the MS medium with 1.0 mg·L-16-BA+0.15 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1GA3was optimal for the shoot multiplication, the proliferation coefficient was up to 3.9 after culturing for 40 days, the MS medium with 1.0 mg·L-1IBA was optimal for rootinginvitro, rooting rate could be up to 41.4%.

Xuehuali; Single bud stem; Rooting;invitroculture; Rapid propagation

2014-05-21

2014-06-20

段瑩瑩(1989-)，女(漢)，在讀碩士，研究方向：果樹(shù)栽培生理。

S661.2

A

1671-8151(2014)05-0464-04

(編輯：馬榮博)