孫雙，張華

(1.黑龍江省森林工業(yè)總局，哈爾濱150008；2.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院，哈爾濱150081)

狗棗獼猴桃[Actinidiakolomikta(Rupr. etMaxim.)Planch.]是獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)落葉藤本植物，作為一種純天然、綠色、野生的可食用漿果，具有抗發(fā)炎、抗病毒、抗氧化、抗癌以及舒張血管等作用，其主要活性成分之一就是黃酮類化合物。

本論文進(jìn)行微波輔助提取狗棗獼猴桃黃酮類化合物的研究：對(duì)提取功率、提取時(shí)間、料液比各因素進(jìn)行研究，進(jìn)行了正交試驗(yàn)和分析，確定的最佳工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料

市售狗棗獼猴桃，經(jīng)過(guò)干燥、超微粉碎，貯存于干燥器中。

1.1.2 試劑

蒸餾水：分析純，市售。無(wú)水乙醇：分析純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≧99.7%，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠。亞硝酸鈉：分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠。硝酸鋁：分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠。 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：生化試劑，遼寧省生物醫(yī)藥研發(fā)中心。氫氧化鈉：分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠。

1.1.3 儀器設(shè)備

真空冷凍干燥機(jī) LG-5，上海市離心機(jī)研究所；高速萬(wàn)能粉碎機(jī) FW-100，天津市泰斯特儀器有限公司；電子分析天平 AB104-N，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；WP65D sancle微波反應(yīng)器 KQ-100DE，南京申科電器公司；電熱恒溫水浴鍋 DK-98-1，天津市泰斯特儀器有限公司；低速離心機(jī) LD5-2A，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；紫外分光光度計(jì) UV-2550，日本島津。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 狗棗獼猴桃黃酮類化合物含量的測(cè)定

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用95%乙醇溶解，定容50mL，得到0.2g/L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，備用。按梯度準(zhǔn)確吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL分別加蒸餾水定容至6mL；加入5%的NaNO2溶液1.0mL，搖勻，放置6min；加入10%的Al(NO3)3溶液 1.0mL，搖勻，放置6min；加入10%的NaOH溶液10mL，搖勻，放置 15min，以吸取0mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的測(cè)試樣為空白樣調(diào)零。于510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.2 狗棗獼猴桃黃酮類化合物的測(cè)定

吸取提取液1.0mL，加蒸餾水定容至6mL；加入5%的NaNO2溶液1.0mL，搖勻，放置6min；加入10%的Al(NO3)3溶液 1.0mL，搖勻，放置6min；加入10%的NaOH溶液10mL，搖勻，放置 15min，以吸取0mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的測(cè)試樣為空白樣調(diào)零。于510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以回歸方程計(jì)算其濃度。

本課題中將狗棗獼猴桃黃酮類化合物的提取量定義為1g狗棗獼猴桃粉末提取出黃酮類化合物的質(zhì)量，提取液中黃酮類化合物的濃度通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得出的，黃酮類化合物提取量的計(jì)算公式如下：

式中c：提取液黃酮類化合物的濃度(mg/mL)；V：提取液的總體積(mL)；M：狗棗獼猴桃的用量(g)。

1.2.2 材料前處理

新鮮野生狗棗獼猴桃冷凍干燥，粉碎機(jī)粉碎，過(guò)篩，備用。

1.2.3 提取工藝路線

狗棗獼猴桃果→干燥粉碎→配成乙醇濃度為95%的料液→微波輔助提取→過(guò)濾→浸提液→離心→濃縮→真空干燥。

1.2.4 微波輔助提取法最佳條件的確定

1.2.4.1 提取時(shí)間的影響。稱取6份樣品，每份含狗棗獼猴桃粉末5.0000g，加入100.0mL蒸餾水。在195W功率條件下，用微波作用提取2、4、6、8、10、12min。然后測(cè)定各種條件下黃酮類化合物的濃度。

1.2.4.2 提取功率的影響。稱取6份樣品，每份含狗棗獼猴桃粉末5.0000g，加入100.0mL蒸餾水。分別在65、195、325、455、585W下提取8min。測(cè)定各種條件下黃酮類化合物的濃度，并計(jì)算出黃酮類化合物的得率。

1.2.4.3 提取料液比的影響。在195W功率下，對(duì)5份5.0000g狗棗獼猴桃粉末分別加入40m(1∶8)，60m( 1∶12)，80mL(l∶16)，100mL(1∶20)和120m(l∶24)95%乙醇，提取2min后測(cè)定各種條件下黃酮類化合物的濃度，并計(jì)算出得率。

1.2.4.4 微波提取法最佳提取條件的確定。在單因素考察試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用正交試驗(yàn)對(duì)各影響因素：時(shí)間、功率和料液比進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。以黃酮類化合物提取量為指標(biāo)，采用三因素三水平的正交表L9(33)進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 微波提取法正交因素水平表 g/L

2 結(jié)果與分析

2.1 微波提取時(shí)間提取量的影響結(jié)果

稱取6份樣品，每份含狗棗獼猴桃粉末5.0000g，加入100.0mL蒸餾水。在195W功率條件下，用微波作用提取2、4、6、8、10、12min。然后測(cè)定各種條件下黃酮類化合物的濃度，并計(jì)算得率，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 提取時(shí)間對(duì)得率的影響

結(jié)果表明，提取時(shí)間對(duì)黃酮類化合物的得率有較大的影響，當(dāng)提取時(shí)間在2～8min時(shí)黃酮類化合物的得率隨時(shí)間增加而增加，提取時(shí)間為8min時(shí)提取己基本完成。時(shí)間超過(guò)8min后，得率隨時(shí)間的增加而下降?？赡苁俏⒉ㄝ椛鋾r(shí)間過(guò)長(zhǎng)局部溫度極高，造成黃酮類化合物分解的緣故。

2.2 微波提取功率對(duì)提取量的影響

稱取6份樣品，每份含狗棗獼猴桃粉末5.0000g，加入100.0mL蒸餾水。分別在65、195、325、455、585W下提取8min。測(cè)定各種條件下黃酮類化合物的濃度，并計(jì)算出黃酮類化合物的得率，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取功率對(duì)得率的影響

由圖2可知，在上述條件下提取功率對(duì)黃酮類化合物的得率影響較大。隨著功率的增大，得率也隨之增加，在585W時(shí)達(dá)最高28.5μg/g。但反應(yīng)器長(zhǎng)時(shí)間高功率作業(yè)，設(shè)備損耗較大:另外微波功率過(guò)高，容易導(dǎo)致提取溶劑氣化嚴(yán)重，從而造成試驗(yàn)誤差。

2.3 提取料液比提取量的影響結(jié)果

在195W功率下，對(duì)5份5.0000g狗棗獼猴桃全草粉末分別加入40m(1∶8)，60m( 1∶12)，80mL(l∶16)，100mL(1∶20)和120m(l∶24)95%乙醇，提取2min后測(cè)定各種條件下黃酮類化合物的濃度，并計(jì)算出得率，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

由圖3知，隨著提取溶劑的增加，黃酮類化合物得率不斷增加。料液比為1∶20時(shí)得率趨于穩(wěn)定?？梢?jiàn)，溶劑量過(guò)小會(huì)影響黃酮類化合物的溶出。

圖3 料液比對(duì)得率的影響

2.4 微波提取法最佳提取條件的確定

在單因素考察試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用正交試驗(yàn)對(duì)各影響因素：時(shí)間、功率和料液比進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。以黃酮類化合物提取量為指標(biāo)，采用三因素三水平的正交表L9(33)進(jìn)行試驗(yàn)。選用正交表3進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)并進(jìn)行方差分析，見(jiàn)表2、3。

由直觀分析知，得率最高組合為A2B1C2，達(dá)26.38μg/g。經(jīng)方差分析，影響顯著性順序?yàn)椋汗β?時(shí)間>料液比。因此，最終實(shí)際提取的最佳工藝條件定為：A2B2C2，即以料液比1∶20，在455W功率下提取8min，此條件下可提取0.607OD黃酮類化合物。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析

3 結(jié)論

微波提法最佳提取條件為微波功率455W、微波提取8min，料液比1∶20，此條件下可提取0.607OD黃酮類化合物。